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Amplificación de desplazamiento múltiple

La amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) es una técnica de amplificación de ADN . Este método puede amplificar rápidamente cantidades diminutas de muestras de ADN hasta una cantidad razonable para el análisis genómico. La reacción comienza con la hibridación de cebadores hexaméricos aleatorios con la plantilla: la síntesis de ADN se lleva a cabo mediante una enzima de alta fidelidad , preferentemente la ADN polimerasa Φ29 . En comparación con las técnicas de amplificación por PCR convencionales , la MDA no emplea cebadores específicos de secuencia, sino que amplifica todo el ADN, genera productos de mayor tamaño con una frecuencia de error menor y funciona a una temperatura constante. La MDA se ha utilizado activamente en la amplificación del genoma completo (WGA) y es un método prometedor para su aplicación en la secuenciación del genoma de una sola célula y en estudios genéticos basados ​​en la secuenciación.

Fondo

Muchos casos biológicos y forenses que implican análisis genéticos requieren la secuenciación de ADN a partir de cantidades minúsculas de muestra, como ADN de células individuales no cultivadas o cantidades traza de tejido recolectado en escenas de crímenes. Los métodos convencionales de amplificación de ADN basados ​​en la reacción en cadena de la polimerasa ( PCR ) requieren cebadores de oligonucleótidos específicos de la secuencia y polimerasa termoestable (generalmente Taq ) , y pueden usarse para generar cantidades significativas de ADN a partir de cantidades minúsculas de ADN. Sin embargo, esto no es suficiente para las técnicas modernas que utilizan análisis de ADN basados ​​en secuenciación. Por lo tanto, es necesario un método no específico de la secuencia más eficiente para amplificar cantidades minúsculas de ADN, especialmente en estudios genómicos de células individuales.

Materiales

Pasos de la reacción de MDA

ADN polimerasa Phi 29

La ADN polimerasa del bacteriófago Φ29 es una enzima de alta procesividad que puede producir amplicones de ADN mayores de 70 pares de kilobases. [1] Su alta fidelidad y actividad de corrección de errores 3'–5' reduce la tasa de error de amplificación a 1 en 10 6 −10 7 bases en comparación con la Taq polimerasa convencional con una tasa de error reportada de 1 en 9,000. [2] La reacción se puede llevar a cabo en una condición isotérmica moderada de 30 °C y por lo tanto no requiere un termociclador . Se ha utilizado activamente en la clonación libre de células, que es el método enzimático de amplificación de ADN in vitro sin cultivo celular ni extracción de ADN . El fragmento grande de la ADN polimerasa Bst también se utiliza en MDA, pero generalmente se prefiere Ф29 debido a su suficiente rendimiento de producto y actividad de corrección de errores. [3]

Cebadores hexaméricos

Los cebadores hexaméricos son secuencias compuestas por seis nucleótidos aleatorios . Para aplicaciones de MDA, estos cebadores suelen estar modificados con tiofosfato en su extremo 3' para transmitir resistencia a la actividad exonucleasa 3'–5' de la ADN polimerasa Ф29 . Las reacciones de MDA comienzan con la hibridación de dichos cebadores con la plantilla de ADN seguida de una elongación de la cadena mediada por la polimerasa. Cada vez se producen más eventos de hibridación de cebadores a lo largo de la reacción de amplificación.

Reacción

La reacción de amplificación se inicia cuando múltiples hexámeros de cebadores se unen a la plantilla. Cuando la síntesis de ADN pasa al siguiente sitio de inicio, la polimerasa desplaza la cadena de ADN recién producida y continúa su elongación. El desplazamiento de la cadena genera una plantilla de ADN monocatenario recién sintetizada para que se unan más cebadores. La posterior unión de cebadores y el desplazamiento de la cadena en la plantilla recién sintetizada dan como resultado una red de ADN hiperramificada. La desramificación de la secuencia durante la amplificación da como resultado un alto rendimiento de los productos. Para separar la red de ramificación del ADN, se utilizan nucleasas S1 para escindir los fragmentos en los sitios de desplazamiento. Las muescas en los fragmentos de ADN resultantes son reparadas por la ADN polimerasa I.

Secuenciación del genoma de una sola célula (MDA).JPG.

Calidad del producto

La MDA puede generar entre 1 y 2 μg de ADN a partir de una sola célula con una cobertura genómica de hasta el 99 %. [4] Los productos también tienen una tasa de error menor y tamaños más grandes en comparación con la amplificación Taq basada en PCR . [4] [5]

Flujo de trabajo general de MDA: [6]

  1. Preparación de la muestra : Las muestras se recogen y se diluyen en el tampón de reacción adecuado (libre de Ca 2+ y Mg 2+ ). Las células se lisan con un tampón alcalino .
  2. Condición : La reacción de MDA con la polimerasa Ф29 se lleva a cabo a 30 °C. La reacción suele tardar entre 2,5 y 3 horas.
  3. Fin de la reacción : Inactivar las enzimas a 65 °C antes de recoger los productos de ADN amplificados.
  4. Los productos de ADN se pueden purificar con un kit de purificación comercial.

Ventajas

El MDA genera una cantidad suficiente de productos de ADN. Es una herramienta poderosa para amplificar moléculas de ADN de muestras, como microorganismos no cultivados o células individuales, hasta la cantidad que sería suficiente para estudios de secuenciación . El gran tamaño de los productos de ADN amplificados con MDA también proporciona una calidad de muestra deseable para identificar el tamaño de los alelos de repetición polimórfica. Su alta fidelidad también lo hace confiable para su uso en la detección de alelos de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). Debido a su desplazamiento de cadena durante la amplificación, el ADN amplificado tiene una cobertura suficiente de las moléculas de ADN de origen, lo que proporciona un producto de alta calidad para el análisis genómico. Los productos de las cadenas desplazadas se pueden clonar posteriormente en vectores para construir una biblioteca para reacciones de secuenciación posteriores .

Limitaciones

Abandono alélico (ADO)

La ADO se define como la no amplificación aleatoria de uno de los alelos presentes en una muestra heterocigótica . Algunos estudios han informado que la tasa de ADO de los productos de MDA es de 0 a 60 %. [7] Este inconveniente disminuye la precisión de la genotipificación de una sola muestra y el diagnóstico erróneo en otras aplicaciones que involucran MDA. La ADO parece ser independiente de los tamaños de los fragmentos y se ha informado que tiene una tasa similar en otras técnicas de células individuales. Las posibles soluciones son el uso de diferentes condiciones de lisis o realizar múltiples rondas de amplificaciones a partir de los productos de MDA diluidos, ya que se ha informado que la amplificación mediada por PCR a partir de células cultivadas da tasas de ADO más bajas.

Amplificación preferencial

La "amplificación preferencial" es la sobreamplificación de uno de los alelos en comparación con el otro. La mayoría de los estudios sobre MDA han informado sobre este problema. Actualmente se observa que el sesgo de amplificación es aleatorio. Podría afectar el análisis de pequeños tramos de ADN genómico para identificar alelos de repeticiones cortas en tándem (STR).

Interacciones cebador-cebador

La interacción endógena entre cebadores independientes de la plantilla se debe al diseño aleatorio de los cebadores hexaméricos. Una posible solución es diseñar cebadores hexanucleótidos aleatorizados y restringidos que no se hibriden de forma cruzada.

Aplicaciones

Secuenciación del genoma de una sola célula

Se han secuenciado células individuales de bacterias, arqueas y protistas no cultivados, así como partículas virales individuales y esporas de hongos individuales con la ayuda de MDA. [8] [9] [10] [11] [12 ] [13 ] [14] [15] [16] [17] [18]

La capacidad de secuenciar células individuales también es útil para combatir enfermedades humanas. Se han amplificado con éxito genomas de células embrionarias humanas individuales para su secuenciación mediante MDA, lo que permite el diagnóstico genético preimplantacional (PGD): detección de problemas de salud genética en un embrión en etapa temprana antes de la implantación . [19] Las enfermedades con propiedades heterogéneas , como el cáncer , también se benefician de la capacidad de la secuenciación genómica basada en MDA para estudiar mutaciones en células individuales.

Los productos MDA de una sola célula también se han utilizado con éxito en experimentos de hibridación genómica comparativa , que normalmente requieren una cantidad relativamente grande de ADN amplificado.

Inmunoprecipitación de cromatina

La inmunoprecipitación de cromatina produce mezclas complejas de fragmentos de ADN relativamente cortos, lo que dificulta su amplificación con MDA sin provocar un sesgo en la representación de los fragmentos. Se propuso un método para evitar este problema, que se basa en la conversión de estas mezclas en concatémeros circulares mediante ligación, seguida de MDA mediada por la ADN polimerasa Φ29. [20]

Análisis forense

La cantidad mínima de muestras recogidas en las escenas del crimen se puede amplificar mediante MDA hasta la cantidad suficiente para el análisis de ADN forense, que se utiliza comúnmente para identificar víctimas y sospechosos.

Véase también

Referencias

  1. ^ Blanco L, Bernad A, Lázaro JM, Martín G, Garmendia C, Salas M (1989). "Síntesis de ADN altamente eficiente por la ADN polimerasa del fago phi 29. Modo simétrico de replicación del ADN". The Journal of Biological Chemistry . 264 (15): 8935–40. doi : 10.1016/S0021-9258(18)81883-X . PMID  2498321.
  2. ^ Tindall KR y Kunkel TA (1988). "Fidelidad de la síntesis de ADN por la ADN polimerasa de Thermus aquaticus". Bioquímica . 27 (16): 6008–13. doi :10.1021/bi00416a027. PMID  2847780.
  3. ^ Hutchison, CA; Smith, HO; Pfannkoch, C; Venter, JC (2005). "Clonación sin células utilizando la ADN polimerasa φ29". Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 102 (48): 17332–6. Bibcode :2005PNAS..10217332H. doi : 10.1073/pnas.0508809102 . PMC 1283157 . PMID  16286637. 
  4. ^ ab Paez JG, Lin M, Beroukhim R, Lee JC, Zhao X, Richter DJ, Gabriel S, Herman P, Sasaki H, Altshuler D, Li C, Meyerson M, Sellers WR (2004). "Cobertura genómica y fidelidad de secuencia de la amplificación de todo el genoma por desplazamiento de múltiples cadenas basada en la polimerasa phi29". Nucleic Acids Research . 32 (9): e71. doi :10.1093/nar/gnh069. PMC 419624 . PMID  15150323. 
  5. ^ Esteban JA, Salas M, Blanco L (1993). "Fidelidad de la ADN polimerasa phi 29. Comparación entre la iniciación con cebado de proteínas y la polimerización de ADN". The Journal of Biological Chemistry . 268 (4): 2719–26. doi : 10.1016/S0021-9258(18)53833-3 . PMID  8428945.
  6. ^ Spits; Le Caignec, C; De Rycke, M; Van Haute, L; Van Steirteghem, A; Liebaers, I; Sermon, K (2006). "Amplificación de desplazamiento múltiple de todo el genoma a partir de células individuales". Nature Protocols . 1 (4): 1965–70. doi :10.1038/nprot.2006.326. PMID  17487184. S2CID  33346321.
  7. ^ Bradley, Ward, Yarborough (2012). "Tasas de pérdida de alelos en la amplificación por desplazamiento múltiple". Applied Biomolecular Techniques . 84 (51): 341–362.{{cite journal}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
  8. ^ Zhang; Martiny, AC; Reppas, NB; Barry, KW; Malek, J; Chisholm, SW; Church, GM (2006). "Secuenciación de genomas de células individuales mediante clonación de polimerasa". Nature Biotechnology . 24 (6): 680–6. doi :10.1038/nbt1214. PMID  16732271. S2CID  2994579.
  9. ^ Stepanauskas, Ramunas; Sieracki, Michael E. (22 de mayo de 2007). "Coincidencia de filogenia y metabolismo en bacterias marinas no cultivadas, una célula a la vez". Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 104 (21): 9052–9057. Bibcode :2007PNAS..104.9052S. doi : 10.1073/pnas.0700496104 . ISSN  0027-8424. PMC 1885626 . PMID  17502618. 
  10. ^ Yoon, Hwan Su; Price, Dana C.; Stepanauskas, Ramunas; Rajah, Veeran D.; Sieracki, Michael E.; Wilson, William H.; Yang, Eun Chan; Duffy, Siobain; Bhattacharya, Debashish (6 de mayo de 2011). "La genómica unicelular revela interacciones entre organismos en protistas marinos no cultivados". Science . 332 (6030): 714–717. Bibcode :2011Sci...332..714Y. doi :10.1126/science.1203163. ISSN  0036-8075. PMID  21551060. S2CID  34343205.
  11. ^ Swan, Brandon K.; Martinez-Garcia, Manuel; Preston, Christina M.; Sczyrba, Alexander; Woyke, Tanja; Lamy, Dominique; Reinthaler, Thomas; Poulton, Nicole J.; Masland, E. Dashiell P. (2011-09-02). "Potencial de quimiolitoautotrofia entre linajes de bacterias ubicuas en el océano oscuro". Science . 333 (6047): 1296–1300. Bibcode :2011Sci...333.1296S. doi :10.1126/science.1203690. ISSN  0036-8075. PMID  21885783. S2CID  206533092.
  12. ^ Woyke, Tanja; Xie, Gary; Copeland, Alex; González, José M.; Han, Cliff; Kiss, Hajnalka; Saw, Jimmy H.; Senin, Pavel; Yang, Chi (23 de abril de 2009). "Ensamblando el metagenoma marino, una célula a la vez". PLOS ONE . ​​4 (4): e5299. Bibcode :2009PLoSO...4.5299W. doi : 10.1371/journal.pone.0005299 . ISSN  1932-6203. PMC 2668756 . PMID  19390573. 
  13. ^ Swan, Brandon K.; Tupper, Ben; Sczyrba, Alexander; Lauro, Federico M.; Martinez-Garcia, Manuel; González, José M.; Luo, Haiwei; Wright, Jody J.; Landry, Zachary C. (9 de julio de 2013). "Prevalencia de la racionalización del genoma y divergencia latitudinal de las bacterias planctónicas en la superficie del océano". Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 110 (28): 11463–11468. Bibcode :2013PNAS..11011463S. doi : 10.1073/pnas.1304246110 . ISSN  0027-8424. PMC 3710821 . PMID  23801761. 
  14. ^ Rinke, Christian; Schwientek, Patrick; Sczyrba, Alexander; Ivanova, Natalia N.; Anderson, Iain J.; Cheng, Jan-Fang; Darling, Aaron; Malfatti, Stephanie; Swan, Brandon K. (julio de 2013). "Información sobre la filogenia y el potencial de codificación de la materia oscura microbiana". Nature . 499 (7459): 431–437. Bibcode :2013Natur.499..431R. doi : 10.1038/nature12352 . hdl : 10453/27467 . ISSN  0028-0836. PMID  23851394.
  15. ^ Kashtan, Nadav; Roggensack, Sara E.; Rodrigue, Sébastien; Thompson, Jessie W.; Biller, Steven J.; Coe, Allison; Ding, Huiming; Marttinen, Pekka; Malmstrom, Rex R. (25 de abril de 2014). "La genómica unicelular revela cientos de subpoblaciones coexistentes en Prochlorococcus silvestre". Science . 344 (6182): 416–420. Bibcode :2014Sci...344..416K. doi :10.1126/science.1248575. hdl : 1721.1/92763 . ISSN  0036-8075. PMID  24763590. S2CID  13659345.
  16. ^ Wilson, William H; Gilg, Ilana C; Moniruzzaman, Mohammad; Campo, Erin K; Koren, Sergey; LeCleir, Gary R; Martínez Martínez, Joaquín; Poulton, Nicole J; Cisne, Brandon K (12 de mayo de 2017). "Exploración genómica de virus oceánicos gigantes individuales". La Revista ISME . 11 (8): 1736-1745. doi :10.1038/ismej.2017.61. ISSN  1751-7362. PMC 5520044 . PMID  28498373. 
  17. ^ Stepanauskas, Ramunas; Fergusson, Elizabeth A.; Brown, Joseph; Poulton, Nicole J.; Tupper, Ben; Labonté, Jessica M.; Becraft, Eric D.; Brown, Julia M.; Pachiadaki, Maria G. (20 de julio de 2017). "Recuperación mejorada del genoma y análisis integrados del tamaño celular de células microbianas individuales no cultivadas y partículas virales". Nature Communications . 8 (1): 84. Bibcode :2017NatCo...8...84S. doi :10.1038/s41467-017-00128-z. ISSN  2041-1723. PMC 5519541 . PMID  28729688. 
  18. ^ Pachiadaki, Maria G.; Sintes, Eva; Bergauer, Kristin; Brown, Julia M.; Record, Nicholas R.; Swan, Brandon K.; Mathyer, Mary Elizabeth; Hallam, Steven J.; Lopez-Garcia, Purificacion (2017-11-24). "El papel principal de las bacterias oxidantes de nitritos en la fijación de carbono en el océano oscuro". Science . 358 (6366): 1046–1051. Bibcode :2017Sci...358.1046P. doi : 10.1126/science.aan8260 . ISSN  0036-8075. PMID  29170234.
  19. ^ Coskun; Alsmadi, O (2007). "Amplificación del genoma completo a partir de una sola célula: una nueva era para el diagnóstico genético preimplantacional". Diagnóstico prenatal . 27 (4): 297–302. doi :10.1002/pd.1667. PMID  17278176. S2CID  22175397.
  20. ^ Shoaib; Baconnais, S; Mechold, U; Le Cam, E; Lipinski, M; Ogryzko, V (2008). "Amplificación por desplazamiento múltiple para mezclas complejas de fragmentos de ADN". BMC Genomics . 9 : 415. doi : 10.1186/1471-2164-9-415 . PMC 2553422 . PMID  18793430.