La amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) es una técnica de amplificación de ADN . Este método puede amplificar rápidamente cantidades diminutas de muestras de ADN hasta una cantidad razonable para el análisis genómico. La reacción comienza con la hibridación de cebadores hexaméricos aleatorios con la plantilla: la síntesis de ADN se lleva a cabo mediante una enzima de alta fidelidad , preferentemente la ADN polimerasa Φ29 . En comparación con las técnicas de amplificación por PCR convencionales , la MDA no emplea cebadores específicos de secuencia, sino que amplifica todo el ADN, genera productos de mayor tamaño con una frecuencia de error menor y funciona a una temperatura constante. La MDA se ha utilizado activamente en la amplificación del genoma completo (WGA) y es un método prometedor para su aplicación en la secuenciación del genoma de una sola célula y en estudios genéticos basados en la secuenciación.
Muchos casos biológicos y forenses que implican análisis genéticos requieren la secuenciación de ADN a partir de cantidades minúsculas de muestra, como ADN de células individuales no cultivadas o cantidades traza de tejido recolectado en escenas de crímenes. Los métodos convencionales de amplificación de ADN basados en la reacción en cadena de la polimerasa ( PCR ) requieren cebadores de oligonucleótidos específicos de la secuencia y polimerasa termoestable (generalmente Taq ) , y pueden usarse para generar cantidades significativas de ADN a partir de cantidades minúsculas de ADN. Sin embargo, esto no es suficiente para las técnicas modernas que utilizan análisis de ADN basados en secuenciación. Por lo tanto, es necesario un método no específico de la secuencia más eficiente para amplificar cantidades minúsculas de ADN, especialmente en estudios genómicos de células individuales.
La ADN polimerasa del bacteriófago Φ29 es una enzima de alta procesividad que puede producir amplicones de ADN mayores de 70 pares de kilobases. [1] Su alta fidelidad y actividad de corrección de errores 3'–5' reduce la tasa de error de amplificación a 1 en 10 6 −10 7 bases en comparación con la Taq polimerasa convencional con una tasa de error reportada de 1 en 9,000. [2] La reacción se puede llevar a cabo en una condición isotérmica moderada de 30 °C y por lo tanto no requiere un termociclador . Se ha utilizado activamente en la clonación libre de células, que es el método enzimático de amplificación de ADN in vitro sin cultivo celular ni extracción de ADN . El fragmento grande de la ADN polimerasa Bst también se utiliza en MDA, pero generalmente se prefiere Ф29 debido a su suficiente rendimiento de producto y actividad de corrección de errores. [3]
Los cebadores hexaméricos son secuencias compuestas por seis nucleótidos aleatorios . Para aplicaciones de MDA, estos cebadores suelen estar modificados con tiofosfato en su extremo 3' para transmitir resistencia a la actividad exonucleasa 3'–5' de la ADN polimerasa Ф29 . Las reacciones de MDA comienzan con la hibridación de dichos cebadores con la plantilla de ADN seguida de una elongación de la cadena mediada por la polimerasa. Cada vez se producen más eventos de hibridación de cebadores a lo largo de la reacción de amplificación.
La reacción de amplificación se inicia cuando múltiples hexámeros de cebadores se unen a la plantilla. Cuando la síntesis de ADN pasa al siguiente sitio de inicio, la polimerasa desplaza la cadena de ADN recién producida y continúa su elongación. El desplazamiento de la cadena genera una plantilla de ADN monocatenario recién sintetizada para que se unan más cebadores. La posterior unión de cebadores y el desplazamiento de la cadena en la plantilla recién sintetizada dan como resultado una red de ADN hiperramificada. La desramificación de la secuencia durante la amplificación da como resultado un alto rendimiento de los productos. Para separar la red de ramificación del ADN, se utilizan nucleasas S1 para escindir los fragmentos en los sitios de desplazamiento. Las muescas en los fragmentos de ADN resultantes son reparadas por la ADN polimerasa I.
La MDA puede generar entre 1 y 2 μg de ADN a partir de una sola célula con una cobertura genómica de hasta el 99 %. [4] Los productos también tienen una tasa de error menor y tamaños más grandes en comparación con la amplificación Taq basada en PCR . [4] [5]
Flujo de trabajo general de MDA: [6]
El MDA genera una cantidad suficiente de productos de ADN. Es una herramienta poderosa para amplificar moléculas de ADN de muestras, como microorganismos no cultivados o células individuales, hasta la cantidad que sería suficiente para estudios de secuenciación . El gran tamaño de los productos de ADN amplificados con MDA también proporciona una calidad de muestra deseable para identificar el tamaño de los alelos de repetición polimórfica. Su alta fidelidad también lo hace confiable para su uso en la detección de alelos de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). Debido a su desplazamiento de cadena durante la amplificación, el ADN amplificado tiene una cobertura suficiente de las moléculas de ADN de origen, lo que proporciona un producto de alta calidad para el análisis genómico. Los productos de las cadenas desplazadas se pueden clonar posteriormente en vectores para construir una biblioteca para reacciones de secuenciación posteriores .
La ADO se define como la no amplificación aleatoria de uno de los alelos presentes en una muestra heterocigótica . Algunos estudios han informado que la tasa de ADO de los productos de MDA es de 0 a 60 %. [7] Este inconveniente disminuye la precisión de la genotipificación de una sola muestra y el diagnóstico erróneo en otras aplicaciones que involucran MDA. La ADO parece ser independiente de los tamaños de los fragmentos y se ha informado que tiene una tasa similar en otras técnicas de células individuales. Las posibles soluciones son el uso de diferentes condiciones de lisis o realizar múltiples rondas de amplificaciones a partir de los productos de MDA diluidos, ya que se ha informado que la amplificación mediada por PCR a partir de células cultivadas da tasas de ADO más bajas.
La "amplificación preferencial" es la sobreamplificación de uno de los alelos en comparación con el otro. La mayoría de los estudios sobre MDA han informado sobre este problema. Actualmente se observa que el sesgo de amplificación es aleatorio. Podría afectar el análisis de pequeños tramos de ADN genómico para identificar alelos de repeticiones cortas en tándem (STR).
La interacción endógena entre cebadores independientes de la plantilla se debe al diseño aleatorio de los cebadores hexaméricos. Una posible solución es diseñar cebadores hexanucleótidos aleatorizados y restringidos que no se hibriden de forma cruzada.
Se han secuenciado células individuales de bacterias, arqueas y protistas no cultivados, así como partículas virales individuales y esporas de hongos individuales con la ayuda de MDA. [8] [9] [10] [11] [12 ] [13 ] [14] [15] [16] [17] [18]
La capacidad de secuenciar células individuales también es útil para combatir enfermedades humanas. Se han amplificado con éxito genomas de células embrionarias humanas individuales para su secuenciación mediante MDA, lo que permite el diagnóstico genético preimplantacional (PGD): detección de problemas de salud genética en un embrión en etapa temprana antes de la implantación . [19] Las enfermedades con propiedades heterogéneas , como el cáncer , también se benefician de la capacidad de la secuenciación genómica basada en MDA para estudiar mutaciones en células individuales.
Los productos MDA de una sola célula también se han utilizado con éxito en experimentos de hibridación genómica comparativa , que normalmente requieren una cantidad relativamente grande de ADN amplificado.
La inmunoprecipitación de cromatina produce mezclas complejas de fragmentos de ADN relativamente cortos, lo que dificulta su amplificación con MDA sin provocar un sesgo en la representación de los fragmentos. Se propuso un método para evitar este problema, que se basa en la conversión de estas mezclas en concatémeros circulares mediante ligación, seguida de MDA mediada por la ADN polimerasa Φ29. [20]
La cantidad mínima de muestras recogidas en las escenas del crimen se puede amplificar mediante MDA hasta la cantidad suficiente para el análisis de ADN forense, que se utiliza comúnmente para identificar víctimas y sospechosos.
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