La óxido nítrico dioxigenasa ( EC 1.14.12.17) es una enzima que cataliza la conversión de óxido nítrico (NO) en nitrato (NO−
3) . [2] La reacción neta para la reacción catalizada por la óxido nítrico dioxigenasa se muestra a continuación:
El óxido nítrico es una pequeña molécula ubicua que está integrada en una amplia variedad de procesos fisiológicos, incluyendo la vasodilatación del músculo liso, la desagregación plaquetaria, la neurotransmisión y la respuesta inmune a la infección bacteriana. [3] [4] La sobreproducción de esta molécula de señalización puede ser letal para las células al envenenar la producción de energía celular. Los objetivos más sensibles del NO son la aconitasa , una enzima que cataliza la isomerización de citrato a isocitrato en el ciclo del ácido cítrico, y la citocromo oxidasa , la última enzima en la cadena de transporte de electrones respiratorios de las mitocondrias. [5] Además, el NO, con su radical solitario en el átomo de nitrógeno, está implicado en una serie de mecanismos secundarios de toxicidad, incluyendo la inhibición de la catalasa (que resulta en toxicidad por peróxido de hidrógeno), la liberación de hierro del centro Fe-S y la formación de complejos de dinitosil-hierro.
Debido a la potencial letalidad del NO, las células se beneficiaron enormemente de la evolución de una enzima capaz de catalizar la conversión del NO tóxico en nitrato. Una 'óxido nítrico dioxigenasa' es una enzima que es capaz de llevar a cabo esta reacción. La NO dioxigenasa pertenece a la familia de las oxidorreductasas , más específicamente aquellas que actúan sobre donantes pareados, con O 2 como oxidante y con incorporación de dos átomos de oxígeno en el otro donante.
El mecanismo de acción aún no ha sido deducido completamente, sin embargo, la teoría principal sugiere que la conversión se lleva a cabo a través de una serie de reacciones redox que involucran centros de hierro como se muestra en la serie de semirreacciones a continuación: [6]
Otra teoría desarrollada más recientemente (2009) sugiere que una actividad de NO dioxigenasa también podría proceder a través de la nitración fenólica mediante un posible intermediario hemo-peroxinitrito. [7]
La NO dioxigenasa más estudiada es la flavohemoglobina (flavoHb), que se muestra a la derecha: Los estudios han demostrado que las flavohemoglobinas son inducidas por NO, nitrito, nitrato y agentes liberadores de NO en varias bacterias y hongos. [6] [8] Además, se ha demostrado que las flavoHb protegen a las bacterias, levaduras y Dictyostelium discoideum contra la inhibición del crecimiento y el daño mediado por el NO. [8] [9] [10]
La dioxigenasa de óxido nítrico se descubrió y se informó por primera vez en 1998 como una actividad enzimática dependiente de O 2 inducible que protegía a las bacterias contra la toxicidad del óxido nítrico . [11] La enzima se identificó con la flavohemoglobina de E. coli . [12]
Más recientemente, se ha identificado otra proteína como una NO dioxigenasa: la proteína hemo de Rhodobacter sphaeroides (SHP), un nuevo citocromo con actividad de NO dioxigenasa. [13] [14] Aunque todavía no se ha identificado la función biológica de la SHP, se ha demostrado que, con oxígeno unido, puede reaccionar rápidamente con óxido nítrico para formar nitrato. [13]
La proteína flavohemoglobina contiene dos dominios: un dominio de unión a FAD de la oxidorreductasa y un dominio de " globina " que contiene hemo de tipo b y, opcionalmente, un dominio de unión a NAD de la oxidorreductasa . El dominio de la reductasa proporciona un electrón al hierro del hemo para lograr una alta tasa de dioxigenación catalítica del NO. Además de numerosas flavohemoglobinas, muchos miembros distantemente relacionados de la superfamilia de la hemoglobina , incluida la mioglobina muscular , la hemoglobina vegetal no simbiótica y la leghemoglobina vegetal simbiótica, la neuroglobulina neuronal y la citoglobina citoplasmática de los mamíferos [15] [16] parecen funcionar como dioxigenasas de óxido nítrico (NOD), aunque el o los donantes de electrones celulares para muchas globinas aún deben definirse. Los donantes de electrones pueden incluir ascorbato, citocromo b 5 o ferredoxina reductasa. [17] La dioxigenación catalítica del NO se puede escribir en su forma más simple:
La catálisis es muy eficiente. Las constantes de velocidad de dioxigenación bimolecular de NO reportadas varían de 2 x 10 7 M −1 s −1 para la citoglobina a 3 x 10 9 M −1 s −1 para la flavohemoglobina, y las velocidades de recambio varían de 1 a 700 s −1 . La estructura, la unión de O 2 y la reducción de globinas parecen optimizadas para una función de dioxigenasa de NO.
Históricamente, la óxido nítrico dioxigenasa (hace unos 1.800 millones de años) sirvió para proporcionar el análogo moderno de la función de la hemoglobina/mioglobina para el almacenamiento y transporte de oxígeno. Gardner et al. (1998) sugirieron que la primera hemoglobina/mioglobina probablemente funcionó como una enzima que utilizaba gas oxígeno "activado" ligado para dioxigenar el NO en los microbios. [6]
La amplia diversidad de organismos multicelulares que se benefician de las funciones de almacenamiento y transporte de oxígeno de la mioglobina/hemoglobina apareció mucho más tarde (hace aproximadamente 500 millones de años).
Ahora se sabe que los NOD cumplen dos funciones fisiológicas importantes en diversas formas de vida: previenen la toxicidad del NO (también conocida como "estrés nitrosativo") y regulan la señalización del NO. [2] Los NOD pertenecen a la familia más grande de enzimas desintoxicantes de radicales libres y oxígeno reactivo bien establecidas que incluyen la superóxido dismutasa , la catalasa y la peroxidasa .
Los NOD, así como muchas hemoglobinas que funcionan como NOD, se distribuyen en la mayoría de las formas de vida, incluidas bacterias, hongos, protistas, gusanos, plantas y animales. De hecho, la dioxigenación del óxido nítrico parece ser una función primordial para los miembros de la superfamilia de la hemoglobina. Además, cada vez es más evidente que la función NOD de las globinas es mucho más común [18] que la función paradigmática de transporte y almacenamiento de O 2 de la hemoglobina de los glóbulos rojos [19] que fue investigada y reportada por primera vez hace más de un siglo por Felix Hoppe-Seyler y otros. [20] Otras proteínas que pueden actuar como NOD incluyen el citocromo P450(s) microsomal de mamíferos [21] y un nuevo citocromo b de unión al O 2 de Rhodobacter sphaeroides . [13]
Se están desarrollando inhibidores de los NOD para su aplicación como antibióticos microbianos, [22] [23] agentes antitumorales y moduladores de la señalización del NO. La clase más destacada de inhibidor de la NO dioxigenasa hasta la fecha son los antibióticos imidazol . Se ha demostrado que los imidazoles se coordinan con el átomo de hierro del hemo de la flavohemoglobina microbiana, perjudican la reducción férrica del hemo, producen una inhibición no competitiva con respecto al O2 y el NO, e inhiben el metabolismo del NO por levaduras y bacterias. [22] Específicamente, se ha demostrado que los imidazoles que tienen sustituyentes aromáticos voluminosos tienen potencial para la inhibición selectiva y de alta afinidad de la función de la NO dioxigenasa coordinando el hierro catalítico del hemo y "encajándose" dentro del gran bolsillo distal hidrofóbico del hemo. [22] [24] [25] Como resultado, se ha sugerido la ingeniería de imidazol como un medio para inhibir específicamente las NO dioxigenasas.
Además, se están desarrollando plantas genéticamente modificadas con flavohemoglobina-NOD heterólogas para limitar la toxicidad del NO creada por el metabolismo de los fertilizantes nitrogenados por los microbios del suelo y como un medio hacia la autofertilización de las plantas a través de la absorción del NO ambiental.
Recientemente se ha descrito un vector lentiviral que permite la expresión de flavoHb de E. coli en células de mamíferos. Este enfoque demostró que flavoHb es de hecho enzimáticamente activo dentro de células humanas y murinas y bloquea potentemente fuentes exógenas y endógenas de estrés nitrosativo. [26] Esta tecnología se amplió luego para interrogar el papel de la síntesis de NO en las células madre cancerosas (CSC) altamente tumorígenas de muestras de glioblastoma (tumor cerebral) humano. La expresión de flavoHb dentro de tumores xenoinjertados condujo al agotamiento del NO generado por iNOS/NOS2. El resultado fenotípico fue la pérdida de tumorigenicidad de las CSC y una mejor supervivencia del ratón. [27] Estos experimentos demuestran que flavoHb se puede emplear para estudios in vivo de la biología del óxido nítrico y sugieren que el agotamiento terapéutico del NO se puede lograr a través de la expresión heteróloga de flavoHb bacterianas.
