Un microscopio de rayos X utiliza radiación electromagnética en la banda de rayos X para producir imágenes ampliadas de objetos. Dado que los rayos X penetran en la mayoría de los objetos, no es necesario prepararlos especialmente para observaciones con microscopía de rayos X.
A diferencia de la luz visible , los rayos X no se reflejan ni refractan fácilmente y son invisibles para el ojo humano. Por lo tanto, un microscopio de rayos X expone una película o utiliza un detector de dispositivo de carga acoplada (CCD) para detectar los rayos X que atraviesan la muestra. Es una tecnología de imágenes de contraste que utiliza la diferencia en la absorción de rayos X suaves en la región de la ventana de agua (longitudes de onda: 2,34–4,4 nm, energías: 280–530 eV) por el átomo de carbono (elemento principal que compone la célula viva) y el átomo de oxígeno (un elemento del agua).
Los rayos X con microenfoque también consiguen un gran aumento mediante proyección. Un tubo de rayos X de microfoco produce rayos X desde un punto focal extremadamente pequeño (de 5 μm a 0,1 μm). Los rayos X se encuentran en el rango de rayos X más convencional (20 a 300 keV) y no se reenfocan.
La historia de la microscopía de rayos X se remonta a principios del siglo XX. Después de que el físico alemán Röntgen descubriera los rayos X en 1895, los científicos pronto iluminaron un objeto utilizando una fuente puntual de rayos X y capturaron las imágenes de las sombras del objeto con una resolución de varios micrómetros. [2] En 1918, Einstein señaló que el índice de refracción de los rayos X en la mayoría de los medios debería ser ligeramente superior a 1, [3] lo que significa que las piezas ópticas refractivas serían difíciles de usar para aplicaciones de rayos X.
Los primeros microscopios de rayos X de Paul Kirkpatrick y Albert Baez utilizaban ópticas de rayos X reflectantes de incidencia rasante para enfocar los rayos X, que rozaban los rayos X de espejos curvos parabólicos en un ángulo de incidencia muy alto . Un método alternativo para enfocar los rayos X es utilizar una pequeña placa de zona de Fresnel de anillos concéntricos de oro o níquel sobre un sustrato de dióxido de silicio . Sir Lawrence Bragg produjo algunas de las primeras imágenes de rayos X utilizables con su aparato a finales de la década de 1940.
En la década de 1950, Sterling Newberry produjo un microscopio de rayos X de sombra, que colocaba la muestra entre la placa fuente y una placa objetivo; esto se convirtió en la base para los primeros microscopios de rayos X comerciales de General Electric Company .
Después de un período de silencio en los años 1960, la microscopía de rayos X recuperó la atención de la gente en los años 1970. En 1972, Horowitz y Howell construyeron el primer microscopio de rayos X basado en sincrotrón en el Acelerador de Electrones de Cambridge. [4] Este microscopio escaneó muestras utilizando radiación sincrotrón desde un pequeño orificio y mostró las capacidades de la microscopía de transmisión y de fluorescencia. Otros desarrollos en este período incluyen la primera demostración holográfica de Sadao Aoki y Seishi Kikuta en Japón, [5] los primeros TXM que utilizan placas zonales de Schmahl et al., [6] y los experimentos de Stony Brook en STXM . [7] [8]
Los usos de fuentes de luz de sincrotrón trajeron nuevas posibilidades para la microscopía de rayos X en los años 1980. Sin embargo, a medida que en muchos grupos se construyeron nuevos microscopios basados en fuentes de sincrotrón, la gente se dio cuenta de que era difícil realizar tales experimentos debido a las capacidades tecnológicas insuficientes en ese momento, como iluminaciones deficientes y coherentes, elementos ópticos de rayos X de mala calidad, y fuentes de luz poco amigables para el usuario. [9]
Al comenzar la década de 1990, nuevos instrumentos y nuevas fuentes de luz impulsaron en gran medida la mejora de la microscopía de rayos X. Se demostraron con éxito métodos de microscopía que incluyen tomografía, crio y criotomografía. Con un rápido desarrollo, la microscopía de rayos X encontró nuevas aplicaciones en la ciencia del suelo, la geoquímica, las ciencias de los polímeros y el magnetismo. El hardware también se miniaturizó para que los investigadores pudieran realizar experimentos en sus propios laboratorios. [9]
Se pueden obtener fuentes de rayos X de 9,25 keV de intensidad extremadamente alta para microscopía de contraste de fase de rayos X, desde un punto focal de aproximadamente 10 μm × 10 μm, con una fuente de rayos X no sincrotrón que utiliza un haz de electrones enfocado y un ánodo de metal líquido. Esto se demostró en 2003 y en 2017 se utilizó para obtener imágenes del cerebro de un ratón con un tamaño de vóxel de aproximadamente un micrómetro cúbico (ver más abajo). [10]
Dado que las aplicaciones siguen creciendo, la microscopía de rayos X se ha convertido en una técnica rutinaria y probada que se utiliza en ciencias ambientales y del suelo, geoquímica y cosmoquímica, ciencias de polímeros, biología, magnetismo y ciencias de materiales. Con esta creciente demanda de microscopía de rayos X en estos campos, se están construyendo en todo el mundo microscopios basados en sincrotrón, ánodo de metal líquido y otras fuentes de luz de laboratorio. También se están comercializando rápidamente componentes y ópticas de rayos X. [9]
La Fuente de Luz Avanzada (ALS) en Berkeley, California, alberga el XM-1, un microscopio de rayos X blandos de campo completo operado por el Centro de Óptica de Rayos X y dedicado a diversas aplicaciones de la nanociencia moderna, como los materiales nanomagnéticos. , ciencias ambientales y de materiales y biología. XM-1 utiliza una lente de rayos X para enfocar los rayos X en un CCD, de manera similar a un microscopio óptico. XM-1 ostentaba el récord mundial en resolución espacial con placas de zona de Fresnel de hasta 15 nm y es capaz de combinar una alta resolución espacial con una resolución temporal inferior a 100 ps para estudiar, por ejemplo, la dinámica de giro ultrarrápida. En julio de 2012, un grupo de DESY afirmó una resolución espacial récord de 10 nm, utilizando el microscopio de barrido de rayos X duros de PETRA III . [11]
El ALS también alberga el primer microscopio de rayos X blandos del mundo diseñado para la investigación biológica y biomédica. Este nuevo instrumento, XM-2, fue diseñado y construido por científicos del Centro Nacional de Tomografía de Rayos X. XM-2 es capaz de producir tomografías tridimensionales de células.
Se pueden obtener fuentes de rayos X de intensidad extremadamente alta de 9,25 keV (línea K-alfa de galio) para microscopía de contraste de fase de rayos X, desde un punto focal de aproximadamente 10 um x 10 um, con una fuente de rayos X que utiliza un Ánodo de galinstan de metal líquido . Esto se demostró en 2003. [10] El metal fluye desde una boquilla hacia abajo a alta velocidad y la fuente de electrones de alta intensidad se enfoca sobre él. El rápido flujo de metal transporta corriente, pero el flujo físico evita una gran cantidad de calentamiento del ánodo (debido a la eliminación de calor por convección forzada) y el alto punto de ebullición del galinstan inhibe la vaporización del ánodo. La técnica se ha utilizado para obtener imágenes del cerebro de un ratón en tres dimensiones con un tamaño de vóxel de aproximadamente un micrómetro cúbico. [12]
Las fuentes de rayos X suaves adecuadas para microscopía, como las fuentes de radiación de sincrotrón , tienen un brillo bastante bajo en las longitudes de onda requeridas, por lo que un método alternativo de formación de imágenes es la microscopía de rayos X suaves de transmisión por barrido. Aquí los rayos X se enfocan en un punto y la muestra se escanea mecánicamente a través del punto focal generado. En cada punto, los rayos X transmitidos se registran mediante un detector como un contador proporcional o un fotodiodo de avalancha . Este tipo de microscopio de rayos X de transmisión de barrido (STXM) fue desarrollado por primera vez por investigadores de la Universidad de Stony Brook y se empleó en la Fuente Nacional de Luz Sincrotrón del Laboratorio Nacional Brookhaven .
La resolución de la microscopía de rayos X se encuentra entre la del microscopio óptico y la del microscopio electrónico . Tiene una ventaja sobre la microscopía electrónica convencional es que puede observar muestras biológicas en su estado natural. La microscopía electrónica se utiliza ampliamente para obtener imágenes con una resolución de nivel nanométrico a sub-Angstrom, pero la célula viva relativamente gruesa no se puede observar ya que la muestra debe fijarse químicamente, deshidratarse, incrustarse en resina y luego cortarse en rodajas ultrafinas. Sin embargo, cabe mencionar que la criomicroscopía electrónica permite observar especímenes biológicos en su estado natural hidratado, aunque incrustados en agua helada. Hasta ahora, son posibles resoluciones de 30 nanómetros utilizando la lente de placa de zona de Fresnel, que forma la imagen utilizando rayos X suaves emitidos por un sincrotrón. Recientemente, se está volviendo más popular el uso de rayos X suaves emitidos a partir de plasmas producidos con láser en lugar de radiación sincrotrón.
Además, los rayos X provocan fluorescencia en la mayoría de los materiales y estas emisiones pueden analizarse para determinar los elementos químicos de un objeto fotografiado. Otro uso es generar patrones de difracción , proceso utilizado en cristalografía de rayos X. Al analizar los reflejos internos de un patrón de difracción (generalmente con un programa de computadora), se puede determinar la estructura tridimensional de un cristal hasta la ubicación de los átomos individuales dentro de sus moléculas. A veces se utilizan microscopios de rayos X para estos análisis porque las muestras son demasiado pequeñas para analizarlas de cualquier otra manera.
Una de las primeras aplicaciones de la microscopía de rayos X en biología fue la imagen de contacto, iniciada por Goby en 1913. En esta técnica, rayos X suaves irradian una muestra y exponen las emulsiones sensibles a los rayos X que se encuentran debajo de ella. Luego, se registran imágenes tomográficas ampliadas de las emulsiones, que corresponden a los mapas de opacidad de rayos X de la muestra, utilizando un microscopio óptico o un microscopio electrónico. Una ventaja única que ofrecían las imágenes de contacto de rayos X sobre la microscopía electrónica era la capacidad de obtener imágenes de materiales biológicos húmedos. Así, se utilizó para estudiar las estructuras a micro y nanoescala de plantas, insectos y células humanas. Sin embargo, varios factores, incluidas las distorsiones de la emulsión, las malas condiciones de iluminación y las bajas resoluciones de las formas de examinar las emulsiones, limitan la resolución de las imágenes por contacto. El daño electrónico de las emulsiones y los efectos de difracción también pueden provocar artefactos en las imágenes finales. [13]
La microscopía de rayos X tiene ventajas únicas en términos de resolución a nanoescala y alta capacidad de penetración, ambas necesarias en estudios biológicos. Con los importantes avances recientes en instrumentos y enfoque, las tres formas clásicas de óptica (difractiva, [14] reflexiva, [15] [16] refractiva [17] ) se han expandido con éxito al rango de rayos X y se han utilizado. investigar las estructuras y dinámicas a escala celular y subcelular. En 2005, Shapiro et al. informaron imágenes celulares de levaduras con una resolución de 30 nm utilizando microscopía de difracción de rayos X suave coherente. [18] En 2008, se demostró la obtención de imágenes por rayos X de un virus sin teñir. [19] Un año más tarde, se aplicó más difracción de rayos X para visualizar la estructura tridimensional de un cromosoma humano sin teñir. [20] La microscopía de rayos X ha demostrado así su gran capacidad para sortear el límite de difracción de los microscopios ópticos clásicos; sin embargo, una mejora adicional de la resolución está limitada por los píxeles del detector, los instrumentos ópticos y el tamaño de las fuentes.
Una de las principales preocupaciones de la microscopía de rayos X desde hace mucho tiempo es el daño por radiación, ya que los rayos X de alta energía producen radicales fuertes y desencadenan reacciones dañinas en muestras húmedas. Como resultado, las muestras biológicas suelen fijarse o liofilizarse antes de irradiarse con rayos X de alta potencia. Los criotratamientos rápidos también se utilizan comúnmente para preservar estructuras hidratadas intactas. [21]
