La tirocidina es una mezcla de decapéptidos cíclicos producidos por la bacteria Brevibacillus brevis que se encuentra en el suelo. Puede estar compuesta por 4 secuencias de aminoácidos diferentes, lo que da como resultado la tirocidina A–D (ver figura 1). La tirocidina es el componente principal de la tirotricina , que también contiene gramicidina . [1] La tirocidina fue el primer antibiótico disponible comercialmente, pero se ha descubierto que es tóxica para la sangre humana y las células reproductivas. Se cree que la función de la tirocidina dentro de su huésped B. brevis es la regulación de la esporulación . [2]
Las tirocidinas A, B y C son decapéptidos cíclicos. La biosíntesis de la tirocidina involucra tres enzimas. Partes de su secuencia son idénticas a la de la gramicidina S.
En 1939, el microbiólogo estadounidense René Dubos descubrió el microbio del suelo Bacillus brevis . Observó la capacidad del microbio para descomponer la cápsula de la bacteria neumococo , volviéndola inofensiva. Del microbio del suelo B. brevis , aisló la tirotricina , que tenía una alta toxicidad para una gran variedad de bacterias. Más tarde se descubrió que la tirotricina era una mezcla de los péptidos gramicidina y tirocidina. Se observó que estos tenían efectos tóxicos en los glóbulos rojos y las células reproductivas en humanos, sin embargo, si se aplica externamente como ungüento, la tirocidina también podría usarse como un potente agente antimicrobiano. [3] El descubrimiento de Dubos ayudó a revivir el interés en la investigación sobre la penicilina .
La tirocidina tiene un modo de acción único en el que altera la función de la membrana celular, lo que la convierte en un objetivo favorable para los derivados de ingeniería. [4] La tirocidina parece perturbar la bicapa lipídica de la membrana interna de un microbio al permear la fase lipídica de la membrana. La afinidad y la ubicación exactas de la tirocidina dentro de la bicapa fosfolipídica aún no se conocen. [5]
La biosíntesis de la tirocidina es similar a la de la gramicidina S y se logra mediante el uso de proteínas sintetasas no ribosómicas (NRPS). [6] Su biosíntesis se realiza mediante un ensamblaje enzimático que consta de 3 proteínas péptido sintetasas, TycA, TycB y TycC, que contienen 10 módulos. Los diferentes análogos de tirocidina (A–D) no son producidos por enzimas diferentes, sino por un sistema enzimático que es capaz de incorporar diferentes aminoácidos de similitud estructural en sitios específicos. La secuencia de aminoácidos está determinada por la organización de la enzima y no por ninguna plantilla de ARN. [7]
Las sintetasas de tirocidina TycA, TycB y TycC están codificadas en el operón de tirocidina. Este consiste en los tres genes que codifican para las tres sintetasas, así como tres marcos de lectura abiertos (ORF) adicionales. Estos ORF, etiquetados como TycD, TycE y TycF, se encuentran aguas abajo de los tres genes de sintetasa (ver figura 2). TycD y TycE tienen la mayor similitud con los miembros de la familia de transportadores de casete de unión a ATP (ABC) que ayudan en el transporte de sustratos a través de una membrana. Se ha sugerido que los transportadores en tándem desempeñan un papel en la concesión de resistencia en la célula productora a través de la secreción de tirocidina. TycF ha sido identificada como una tioesterasa (TE) y es similar a otras TE en operones bacterianos utilizados para codificar sintetasas de péptidos. Sin embargo, la función precisa de estos TE sigue siendo desconocida. [2] El tamaño de las sintetasas de péptidos corresponde a la cantidad de activación que llevan a cabo. TycA es el más pequeño y activa un solo aminoácido de un módulo, TycB es de tamaño intermedio y activa 3 aminoácidos con 3 módulos, y TycC es el más grande y activa 6 aminoácidos con 6 módulos (ver figura 3). [2]
Cada módulo realiza todas las reacciones catalíticas necesarias para incorporar un solo aminoácido a la cadena peptídica. Esto se logra a través de los subdominios de adenilación (A), proteína transportadora de peptitilo (PCP), condensación (C) y, dependiendo de la posición del aminoácido, una epimerización (E). El subdominio de adenilación se utiliza para activar el aminoácido específico. Cada módulo utiliza una molécula del aminoácido sustrato seleccionado con una molécula de ATP para dar un complejo enzimático de aminoacilato adenilato y pirofosfato. El aminoácido activado puede luego transferirse a la enzima unida a la fosfopanteteína 4' de la proteína transportadora con la expulsión del AMP del sistema. La proteína transportadora utiliza el grupo prostético 4'-fosfopanteteína para cargar el péptido en crecimiento y sus precursores monómeros. [8] La elongación de la cadena peptídica se logra a través de la condensación del PCP corriente arriba sobre un monómero adyacente corriente abajo unido a PCP. Algunos dominios tienen subdominios de modificación, como el subdominio E que se observa en los dominios 1 y 4 en la tirocidina, que generará el aminoácido configurado en D. En el módulo final se encuentra el dominio TE que se utiliza como catalizador para la ciclización o liberación del producto. La liberación del producto de la proteína transportadora se logra mediante la acilación de la serina del sitio activo de la TE en la que el decapéptido se transfiere del éter tiólico al residuo de serina. La desacilación puede ocurrir luego mediante ciclización intramolecular o mediante hidrólisis para dar el producto cíclico o lineal respectivamente (ver figura 4).
En el caso de la tirocidina, se ha demostrado que el cierre del anillo es muy favorable debido a los 4 enlaces de H que ayudan a que la cadena principal del decapéptido adopte una conformación estable (véase la figura 5). [4] [8] Esta ciclización intramolecular se produce de manera de cabeza a cola involucrando el extremo N del D -Phe1 y el extremo C del L -Leu10 (véase la figura 4). [6] [9]
No existe una solución bioquímica general para la macrociclación de una cadena peptídica. Los dominios TE de tirocidina (Tyc) aislados se pueden utilizar para ciclar sustratos de peptidil-tioéster derivados químicamente, lo que proporciona una ruta poderosa para nuevos compuestos cíclicos. Para que se produzca esta macrociclación, la cadena peptídica debe activarse en su extremo C con un grupo saliente de N -acetilcisteamina (SNAC) . [6] Un escaneo de alanina a través de las 10 posiciones de tirocidina muestra que solo se requieren D -Phe y L -Orn para una ciclización suficiente.
El TE Tyc también se puede utilizar de forma biomimética, imitando el entorno creado por el dominio TE con el PCP del sustrato mediante el uso de un anclaje sintético unido a una resina de amida de polietilenglicol (PEG). [8] El uso de esta resina unida a un sustrato deseado con TE aislado puede permitir la liberación catalítica de la resina, así como la macrociclización del sustrato (véase la figura 6 [8] ). El uso de la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) permitió la incorporación de una amplia variedad de monómeros a la cadena peptídica. Estudios posteriores utilizaron la alta tolerancia del TE Tyc para modificar la cadena principal del péptido de forma postsintética. Esto también permitió la incorporación de la glicosilación de los residuos de tirosina o serina. [6] El uso de estos métodos ha dado lugar a muchos agentes terapéuticos nuevos y prometedores. [ cita requerida ]
