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Sistema libre de células

Un sistema libre de células es una herramienta in vitro ampliamente utilizada para estudiar reacciones biológicas que ocurren dentro de las células , aparte de un sistema celular completo, reduciendo así las interacciones complejas que se encuentran típicamente cuando se trabaja en una célula completa. [1] Las fracciones subcelulares se pueden aislar por ultracentrifugación para proporcionar maquinaria molecular que se puede utilizar en reacciones en ausencia de muchos de los otros componentes celulares. [2] Los componentes internos de células eucariotas y procariotas se han utilizado para la creación de estos entornos simplificados. [3] [4] Estos sistemas han permitido que surgiera la biología sintética libre de células , proporcionando control sobre qué reacción se está examinando, así como su rendimiento, y reduciendo las consideraciones que de otro modo se invocan al trabajar con células vivas más sensibles. [5]

Tipos

Los sistemas libres de células se pueden dividir en dos clasificaciones principales: basados ​​en extractos celulares, que extraen componentes de dentro de una célula completa para uso externo, y basados ​​en enzimas purificadas, que utilizan componentes purificados de las moléculas que se sabe que están involucradas en un proceso determinado. [6] [7] El tipo basado en extractos celulares es susceptible a problemas como la degradación rápida de componentes fuera de su huésped, como se muestra en un estudio de Kitaoka et al. donde un sistema de traducción libre de células basado en Escherichia coli ( E. coli ), del tipo basado en extractos celulares, tuvo la plantilla de ARNm degradada muy rápidamente y condujo a la detención de la síntesis de proteínas . [8]

Preparación

Los métodos de preparación varían entre situaciones de ambos tipos de sistemas libres de células.

Basado en extractos de células

El premio Nobel Eduard Buchner fue posiblemente el primero en presentar un sistema libre de células usando extractos de levadura , pero desde entonces se han encontrado fuentes alternativas. [9] [10] E. coli , germen de trigo y reticulocitos de conejo han demostrado ser útiles para crear sistemas libres de células mediante la extracción de sus componentes internos. [3] [11] Los extractos de E. coli 30S se han adquirido, por ejemplo, moliendo las bacterias con alúmina , seguido de una limpieza adicional. [12] De manera similar, el germen de trigo se ha molido con arena lavada con ácido o vidrio en polvo para abrir las membranas celulares . [13] [14] Los reticulocitos de conejo se han lisado en una solución de MgCl2 y se ha filtrado el extracto de las membranas mediante centrifugación. [15]

Usos

Los biosistemas de biotransformación de vías sintéticas libres de células se proponen como una nueva plataforma de biofabricación de bajo costo en comparación con la fermentación microbiana utilizada durante miles de años. [3] [16] Los biosistemas libres de células tienen varias ventajas adecuadas para aplicaciones industriales: [6]

C 6 H 10 O 5 (l) + 7 H 2 O (l) → 12 H 2 (g) + 6 CO 2 (g),
Se ha producido casi 12 H 2 por unidad de glucosa de polisacáridos y agua , tres veces el rendimiento teórico de los mejores microorganismos anaeróbicos productores de hidrógeno . [17]

Síntesis de proteínas

Los biosistemas in vitro se pueden controlar y acceder fácilmente sin membranas. [16] Cabe destacar que, en un trabajo que condujo a un premio Nobel, el experimento de Nirenberg y Matthaei utilizó un sistema libre de células, del tipo basado en extractos celulares, para incorporar aminoácidos elegidos marcados radiactivamente en proteínas sintetizadas con 30S extraído de E. coli . [12] [21] Estudios más recientes, como el estudio realizado por Spirin et al. con la versión procariota y eucariota de su sistema de traducción libre de células, también han sintetizado proteínas con mayor producción, incorporando técnicas como el flujo continuo para agregar materiales y eliminar productos. [22] Con estos avances en el rendimiento, se han ampliado las aplicaciones de productividad, como la síntesis de proteínas de fusión para servir potencialmente como vacunas para los linfomas de células B. [23] Además, la síntesis de proteínas libre de células se está convirtiendo en una nueva opción alternativa para la síntesis rápida de proteínas. [6]

Manipulación metabólica

La ingeniería de procesos metabólicos se ha logrado a través de sistemas libres de células. [24] [10] [3] Bujara et al. , por ejemplo, pudieron utilizar extractos de redes glucolíticas , que consisten en enzimas de E. coli que produjeron fosfato de dihidroxiacetona , para analizar en tiempo real las concentraciones de metabolitos mientras alteraban los niveles de enzimas, con el resultado de una producción óptima de fosfato de dihidroxiacetona . [25] Además, Calhoun y Swartz pudieron utilizar un intermedio glucolítico para alimentar un sistema libre de células, lo que permitió una generación de ATP relativamente económica en comparación con el uso de reactivos en reacciones de fosfoenolpiruvato . [26]

Incorporación de aminoácidos no naturales

Los sistemas libres de células también se han utilizado para incorporar aminoácidos no naturales . [26] [27] Shimizu et al. pudieron cambiar un codón de terminación a un codón de sentido omitiendo el factor de liberación RF1 , lo que indica la capacidad de insertar los aminoácidos deseados en situaciones no naturales. Esto es útil en sistemas donde trabajar dentro de una célula es problemático, como el proceso de metabolismo de aminoácidos que impide el etiquetado específico de aminoácidos que sería útil en la espectroscopia de RMN multidimensional . [28] Kigawa et al. pudieron etiquetar con éxito aminoácidos en un sistema libre de células donde el metabolismo de aminoácidos ya no estaba presente, lo que hace que dichos sistemas sean útiles para los estudios de RMN. [28]

Referencias

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