Un elemento de desenrollado de ADN ( DUE o DNAUE ) es el sitio de iniciación para la apertura de la estructura de doble hélice del ADN en el origen de replicación para la síntesis de ADN . [1] Es rico en AT y se desnaturaliza fácilmente debido a su baja estabilidad helicoidal, [2] lo que permite que la región monocatenaria sea reconocida por el complejo de reconocimiento de origen .
Los DUE se encuentran tanto en organismos procariotas como eucariotas , pero fueron descubiertos por primera vez en orígenes de levaduras y bacterias, por Huang Kowalski. [3] [4] El desenrollado del ADN permite el acceso de la maquinaria de replicación a las nuevas hebras simples. [1] En eucariotas, los DUE son el sitio de unión para las proteínas de unión del elemento de desenrollado del ADN (DUE-B) necesarias para el inicio de la replicación. [3] En procariotas, los DUE se encuentran en forma de secuencias de consenso en tándem que flanquean el extremo 5' del dominio de unión de DnaA. [2] El acto de desenrollarse en estos elementos ricos en AT ocurre incluso en ausencia de cualquier proteína de unión al origen debido a fuerzas de superenrollamiento negativas , lo que lo convierte en una acción energéticamente favorable. [2] Los DUE se encuentran típicamente abarcando 30-100 pb de orígenes de replicación. [4] [5]
El desenrollado específico de la DUE permite el ensamblaje del complejo de iniciación en el sitio de replicación en el ADN monocatenario, como descubrió Huang Kowalski. [4] La helicasa de ADN y las enzimas asociadas ahora pueden unirse a la región desenrollada, creando un inicio de horquilla de replicación . El desenrollado de esta región de cadena dúplex está asociado con un bajo requerimiento de energía libre, debido a la inestabilidad helicoidal causada por interacciones específicas de apilamiento de bases, en combinación con la superenrollación contrarrestada. [4] [6] La superenrollación negativa permite que el ADN sea estable al fundirse, impulsada por la reducción de la tensión de torsión. [5] Se encuentra en los orígenes de replicación tanto de bacterias como de levaduras, así como también en algunos mamíferos. [5] Se encontró que tiene entre 30 y 100 pb de longitud. [4] [5]
En los procariotas, la mayor parte del tiempo la replicación del ADN se produce a partir de un único origen de replicación en una única cadena de secuencia de ADN. Ya sea que este genoma sea lineal o circular, las bacterias tienen su propia maquinaria necesaria para que se produzca la replicación. [7]
En las bacterias, la proteína DnaA es el iniciador de la replicación. [8] Se carga en oriC en una secuencia de la caja DnaA donde se une y ensambla filamentos para abrir el dúplex y reclutar la helicasa DnaB con la ayuda de DnaC . DnaA está altamente conservada y tiene dos dominios de unión al ADN. Justo aguas arriba de esta caja DnaA, hay tres secuencias en tándem de 13 meros. Estas secuencias en tándem, etiquetadas como L, M, R de 5' a 3' son los DUE bacterianos. Dos de cada tres de estas regiones ricas en AT (M y R) se desenrollan al unirse DnaA a la caja DnaA, a través de la proximidad al dúplex desenrollado. La secuencia final de 13 meros L, más alejada de esta caja DnaA, finalmente se desenrolla cuando la helicasa DnaB la rodea. Esto forma una burbuja de replicación para que luego continúe la replicación del ADN. [2]
Las arqueas utilizan un homólogo más simple del complejo de reconocimiento de origen eucariota para encontrar el origen de la replicación, en secuencias denominadas caja de reconocimiento de origen (ORB). [9]
El desenrollado de estos tres DUE es un paso necesario para que se inicie la replicación del ADN. La atracción distante de la fusión del dúplex en la secuencia de la caja DnaA es lo que induce una mayor fusión en los sitios DUE M y R. El sitio L más distante se desenrolla luego por la unión de DnaB. El desenrollado de estos sitios de 13 meros es independiente de las proteínas de unión a oriC. Es la generación de superenrollado negativo lo que causa el desenrollado. [2]
Se compararon experimentalmente las tasas de desenrollado del ADN en las tres DUE de E. coli mediante espectroscopia de resonancia nuclear. En condiciones fisiológicas, la eficiencia de apertura de cada una de las secuencias ricas en AT difería entre sí. En gran medida, debido a las diferentes secuencias que las rodeaban a distancia. [2]
Además, se descubrió que la fusión de los pares de bases AT/TA era mucho más rápida que la de los pares GC/CG (15-240 s −1 frente a ~20 s −1 ). Esto respalda la idea de que las secuencias AT son evolutivamente favorecidas en los elementos DUE debido a su facilidad de desenrollado. [2]
Las tres secuencias de 13 meros identificadas como DUE en E. coli están bien conservadas en el origen de replicación de todas las bacterias entéricas documentadas . Se realizó una secuencia de consenso general mediante la comparación de bacterias conservadas para formar una secuencia de 11 bases, GATCTnTTnTTTT . E. coli contiene 9 bases de la secuencia de consenso de 11 bases en su oriC, dentro de las secuencias de 13 meros. Estas secuencias se encuentran exclusivamente en el único origen de replicación; no en ningún otro lugar dentro de la secuencia del genoma. [2]
Los mecanismos de replicación eucariotas funcionan de manera relativamente similar a los de los procariotas, pero están sujetos a una regulación más precisa. [10] Es necesario garantizar que cada molécula de ADN se replique solo una vez y que esto ocurra en el lugar adecuado en el momento adecuado. [7] Opera en respuesta a señales extracelulares que coordinan el inicio de la división, de manera diferente de un tejido a otro. Las señales externas desencadenan la replicación en la fase S a través de la producción de ciclinas que activan las quinasas dependientes de ciclina (CDK) para formar complejos. [10]
La replicación del ADN en eucariotas se inicia con la unión del complejo de reconocimiento de origen (ORC) al origen. Esto ocurre en la fase celular G 1 y sirve para impulsar el ciclo celular hacia la fase S. Esta unión permite la unión de más factores para crear un complejo prerreplicativo (pre-RC). El pre-RC se activa cuando la quinasa dependiente de ciclina (CDK) y la quinasa dependiente de Dbf4 (DDK) se unen a él. Los complejos de iniciación permiten entonces el reclutamiento del activador de la helicasa MCM Cdc45 y el posterior desenrollado del dúplex en el origen. [10] [11]
La replicación en eucariotas se inicia en varios sitios de la secuencia, formándose múltiples horquillas de replicación simultáneamente. Esta eficiencia es necesaria para los grandes genomas que necesitan replicarse. [10]
En los eucariotas, las estructuras de los nucleosomas pueden complicar el inicio de la replicación. [4] Pueden bloquear el acceso de los DUE-B al DUE, suprimiendo así el inicio de la transcripción. [4] Pueden impedir la velocidad. Sin embargo, la naturaleza lineal del ADN eucariota, frente al ADN circular procariota, hace que sea más fácil desenrollar su dúplex una vez que se ha desenrollado correctamente del nucleosoma. [4] La actividad del DUE puede ser modulada por factores de transcripción como ABF1. [4]
Un sistema modelo de levadura común que representa bien la replicación eucariota es Saccharomyces cerevisiae . [12] Posee secuencias de replicación autónoma (ARS) que se transforman y mantienen bien en un plásmido. Se considera que algunas de estas ARS actúan como orígenes de replicación. Estas ARS están compuestas por tres dominios A, B y C. El dominio A es donde reside la secuencia de consenso de ARS , denominada ACS. El dominio B contiene la DUE. Por último, el dominio C es necesario para facilitar las interacciones proteína-proteína . [12] Las ARS se encuentran distribuidas en 16 cromosomas, repetidas cada 30-40 kb. [12]
Entre especies, estas secuencias ARS son variables, pero sus dominios A, B y C están bien conservados. [12] Cualquier alteración en el DUE (dominio B) provoca una menor función general del ARS en su conjunto en la iniciación de la replicación. Esto se encontró a través de estudios que utilizaron intercambio de iminos y espectroscopia de RMN . [2]
Se han encontrado DUE en algunos orígenes de replicación de mamíferos hasta la fecha. En general, se han analizado muy pocos orígenes de replicación de mamíferos, por lo que es difícil determinar la prevalencia de los DUE en sus orígenes de replicación definidos. [5]
Las células humanas aún tienen muy pocos detalles sobre sus orígenes. [5] Se sabe que la replicación se inicia en grandes áreas de la zona de iniciación, asociadas con proteínas conocidas como el gen c-myc y el gen β-globina. Se cree que las que tienen DUE actúan casi de la misma manera que las células de levadura. [5]
Debido al origen de los plásmidos en células de mamíferos, SV40 se encontró que está asociado con un hexámero T-ag, que introduce un superenrollamiento opuesto para aumentar la favorabilidad del desenrollado de la cadena. [4]
Los mamíferos con DUE han mostrado evidencia de capacidades de formación de estructuras que proporcionan estabilidad monocatenaria al ADN desenrollado. Estas incluyen cruciformes , tríplex intramoleculares y más. [5]
Las proteínas del elemento de desenrollado del ADN (DUE-B) se encuentran en eucariotas. [3]
Actúan para iniciar la separación de la cadena mediante la unión a DUE. [3] Homólogos de secuencia DUE-B encontrados entre una variedad de especies animales: peces, anfibios y roedores. [3] Los DUE-B tienen dominios C-terminales desordenados que se unen a DUE mediante el reconocimiento de este C-terminal. [3] No hay otra especificidad de secuencia involucrada en esta interacción. [3] Confirmado por la inducción de mutaciones a lo largo de la secuencia DUE-B, pero en todos los casos las capacidades de dimerización permanecen intactas. [3] Al unirse al ADN, el C-terminal se ordena, lo que imparte una mayor estabilidad contra la degradación de la proteasa . [3] Los DUE-B son 209 residuos en total, 58 de los cuales están desordenados hasta que se unen a DUE. [3] Los DUE-B hidrolizan ATP para funcionar. [3] También poseen una secuencia similar a la aminoacil-ARNt sintetasa , y anteriormente se clasificaron como tales. [13] Los DUE-B forman homodímeros que crean una estructura secundaria de lámina beta extendida que se extiende a través de ellos. [3] Dos de estos homodímeros se unen para formar la estructura asimétrica general del DUE-B. [3]
En la formación del pre-RC, Cdc45 se localiza en el DUE para su actividad a través de la interacción con un DUE-B. [11] Lo que permite el desenrollado del dúplex y el inicio de la replicación. [11]
En los humanos, los DUE-B tienen 60 aminoácidos más que sus contrapartes ortólogas de levadura . [13] Ambos se localizan principalmente en el núcleo. [13]
Los niveles de DUE-B se mantienen en cantidades constantes, independientemente del ciclo celular. [13] Sin embargo, en la fase S , los DUE-B pueden fosforilarse temporalmente para evitar la replicación prematura. [13] La actividad de DUE-B está controlada covalentemente. [13] El ensamblaje de estos DUE-B en las regiones DUE depende de la actividad de la quinasa y la fosfatasa locales. [13] Los DUE-B también pueden ser regulados a la baja por ARNi y se los ha implicado en etapas G1 extendidas. [13]
Las mutaciones que afectan el desenrollado en los sitios DUE impiden directamente la actividad de replicación del ADN. [14] Esto puede ser el resultado de deleciones/cambios en la región DUE, la adición de reactivos reactivos o la adición de una nucleasa específica . [4] Sin embargo, los sitios DUE son relativamente insensibles a las mutaciones puntuales , manteniendo su actividad cuando se alteran las bases en los sitios de unión de proteínas. [4] En muchos casos, la actividad DUE se puede recuperar parcialmente aumentando la temperatura. [4] También se puede recuperar mediante la readición del sitio DUE. [3]
Si hay una mutación lo suficientemente grave en DUE que hace que ya no se una a DUE-B, Cdc45 no puede asociarse y no se unirá al factor de transcripción c-myc. Esto se puede recuperar en expansiones de longitud relacionadas con la enfermedad (ATTCT)(n) de la secuencia DUE. Si la actividad DUE se recupera en exceso, podría causar una formación de origen desregulada y una progresión del ciclo celular. [11]
En los eucariotas, cuando se eliminan los DUE-B, la célula no pasa a la fase S de su ciclo, donde se produce la replicación del ADN. Como resultado, aumenta la apoptosis . [3] Pero la actividad se puede recuperar mediante la adición de los DUE-B, incluso de una especie diferente. Esto se debe a que los DUE-B son homólogos entre especies. [3] Por ejemplo, si los DUE-B en un huevo de Xenopus están mutados, no se producirá ninguna replicación del ADN, pero se puede salvar mediante la adición de DUE-B de HeLa para recuperar la funcionalidad completa. [3]