Interpretó a Harold Hutchins en Captain Underpants: The First Epic Movie (2017).

[4]​ En su lugar, optó por hacer sketchs por su cuenta, y trabajó en una tienda New Balance para obtener dinero.

Luego se mudó a Chicago, donde tomó clases en The Second City y iO Theatre, mientras también actuaba regularmente.

Mientras realizaba un crucero en Second City, obtuvo una audición para Saturday Night Live .

Mientras vivía en la ciudad de Nueva York, Middleditch comenzó a actuar en anuncios.

En 2007, McDonald's compró un video sketch para Chicken McNuggets que hizo con Fernando Sosa en Chicago y lo utilizó como anuncio.

[18]​[19]​ En 2016, Middleditch obtuvo su primera nominación al Premio Primetime Emmy por Mejor actor principal en una serie de comedia por su actuación en el programa.

El 16 de octubre de 2013, se anunció que la serie animada producida por Disney XD Penn Zero: Part-Time Hero protagonizaría a Middleditch como el héroe titular del salto del multiverso.

[25]​ En 2014 se unió a una serie de CollegeHumor en YouTube llamada CAMP.

Middleditch dobló a Harold Hutchins en la película animada de DreamWorks Captain Underpants: The First Epic Movie (2017), basada en el libro de Dav Pilkey Captain Underpants .