La frase «separación de la iglesia y el Estado» es usada por Thomas Jefferson y otros expresando un entendimiento de la intención y función de la Cláusula de Establecimiento y la Cláusula de Practica Libre de la Primera Enmienda a la Constitución de Estados Unidos que dice "El Congreso no hará ninguna ley respecto al establecimiento de una religión, o prohibirá la práctica libre de las mismas..." La frase "separación de la iglesia y el estado" es generalmente relacionada con la Carta del 1 de enero de 1802 escrita por Thomas Jefferson, dirigida a la Asociación Bautista de Danbury en Connecticut, y publicada en un periódico de Massachusetts.
Jefferson escribió: Jefferson imitaba el lenguaje del fundador de la primera iglesia bautista de América, Roger Williams, quien en 1644 escribió sobre una "Cobertura o muro de separación entre el jardín de la iglesia y el desierto de el mundo."
El Artículo Seis de la Constitución de Estados Unidos también especifica que "nunca se requerirá ninguna prueba religiosa como calificación para alguna oficina o fideicomiso público de Estados Unidos."
En Everson v. Board of Education (1947), el Juez Hugo Black escribió: "En las palabras de Thomas Jefferson, la cláusula contra el establecimiento de la religión por la ley fue pensada para erigir un Muro de Separación entre la Iglesia y el Estado."
Sin embargo, la corte no siempre ha interpretado el principio constitucional como absoluto, y el grado apropiado de separación entre gobierno y religión en Estados Unidos sigue siendo un tema continuo de debate apasionado.