Desde 2006 hasta 2009, Stamos tuvo un papel estelar en la serie médica de NBC ER como el Dr. Tony Gates.

John comenzó su carrera de actor con un papel en televisión, en la serie General Hospital como Blackie Parrish, por lo que recibió una nominación al Premio Daytime Emmy en 1984.

Aunque la serie se canceló después de ocho temporadas, todavía mantiene una estrecha relación con sus compañeros de trabajo, Bob Saget, Dave Coulier, Lori Loughlin, Jodie Sweetin, Mary-Kate y Ashley Olsen, y Candace Cameron Bure.

A partir de 2010, la serie salió al aire en Nick at Nite en ABC Family.

Tuvo papeles protagonistas en la serie de televisión Thieves (2001), y Jake in Progress (2005).

En 2003, Stamos tuvo un papel invitado en la serie Friends, apareciendo en el episodio "The One With The Donor", interpretando a un hombre que fue al apartamento de Chandler y Mónica para cenar, sin saber que en realidad lo estaban entrevistando para ser donante de esperma.

En 2006, protagonizó dos episodios en la temporada 12 de ER, como el paramédico que luego es pasante Tony Gates.

El productor ejecutivo John Wells informó que lo quería en la temporada antes pero Stamos fue contratado para Jake in Progress.

En agosto de 2008, Stamos fue anunciado en The Roast of Bob Saget en Comedy Central.

En 1990, tocó la batería y grabó una canción con The Beach Boys de la comedia Problem Child.

[9]​ Por otro lado, ganó un Premio Golden Icon 2009-2010 como mejor actor en un musical por su actuación en esa producción.

John presentó la canción en el episodio donde Jesse Katsopolis, su personaje, muestra el vídeo musical a la familia.

John Stamos también se presentó en un álbum independiente en 1994 titulado Shades of Blue junto con Lanny Cordola, Gary Griffin, Sandra Stephens, Tony Guerrero, y David Enos.