El método de clonación Gateway , inventado y comercializado por Invitrogen desde finales de los años 1990, es el método de clonación de las reacciones de integración y escisión recombinación que tienen lugar cuando el bacteriófago lambda infecta bacterias. Esta tecnología proporciona una forma rápida y altamente eficiente de transportar secuencias de ADN a sistemas multivectoriales para el análisis funcional y la expresión de proteínas utilizando sitios Gateway att y dos mezclas de enzimas patentadas llamadas BP Clonase y LR Clonase. In vivo, estas reacciones de recombinación se ven facilitadas por la recombinación de los sitios de unión del cromosoma lambda/fago (attP) y las bacterias (attB). Como resultado de la recombinación entre los sitios attP y attB, el fago se integra en el genoma bacteriano flanqueado por dos nuevos sitios de recombinación (attLeft y attRight). La eliminación del fago del cromosoma bacteriano y la regeneración de los sitios attP y attB pueden resultar de la recombinación de los sitios attL y attR en circunstancias específicas.
Las secuencias de ADN que se van a clonar se agregan a versiones modificadas de estos sitios especiales Gateway Att. Tienen lugar dos reacciones enzimáticas, BP Clonasa y LR Clonasa. La BP Clonasa se produce entre los sitios attB que rodean el inserto y los sitios attP del vector donante. Esta reacción es catalizada por la mezcla de enzimas BP Clonasa y produce el clon de entrada que contiene el ADN de interés flanqueado por dominios attL. Como subproducto de la reacción, el gen ccdB se corta del vector donante. La LR Clonasa se produce entre las regiones attL del clon de entrada generado y las regiones attR del vector objetivo y es catalizada por la mezcla de enzimas LR Clonasa. Como resultado, se produce un clon de expresión con ADN de interés flanqueado por regiones attB. Como en la reacción BP, se corta una secuencia de ADN que contiene el gen ccdB del vector objetivo.
Se han clonado grandes archivos de clones de Gateway Entry, que contienen la gran mayoría de ORF ( marcos de lectura abiertos ) humanos, de ratón y de rata, a partir de bibliotecas de ADNc humano o se han sintetizado químicamente para apoyar a la comunidad de investigación utilizando fondos de los NIH (Institutos Nacionales de Salud) (por ejemplo, Colección de genes de mamíferos, http://mgc.nci.nih.gov/ Archivado el 25 de febrero de 2015 en Wayback Machine ). La disponibilidad de estos casetes de genes en un plásmido de clonación Gateway estándar ayuda a los investigadores a transferir rápidamente estos casetes a plásmidos que facilitan el análisis de la función de los genes. La clonación de puerta de enlace requiere más tiempo para la configuración inicial y es más costosa que los métodos tradicionales de clonación basados en enzimas de restricción y ligasa, pero ahorra tiempo y ofrece una clonación más simple y altamente eficiente para aplicaciones posteriores.
La tecnología ha sido ampliamente adoptada por la comunidad de investigación de ciencias biológicas, especialmente para aplicaciones que requieren la transferencia de miles de fragmentos de ADN en un tipo de plásmido (por ejemplo, uno que contenga un promotor CMV para la expresión de proteínas en células de mamíferos), o para la transferencia de un fragmento de ADN en muchos tipos diferentes de plásmidos (p. ej., para la expresión de proteínas en bacterias, insectos y mamíferos).
El primer paso en la clonación de Gateway es la preparación de un clon de Gateway Entry. Hay algunas formas diferentes de clonar la entrada.
El segundo paso en la clonación de Gateway es la preparación de un vector de destino de Gateway. Es importante elegir el vector objetivo que mejor se adapte a su objetivo al preparar el clon de expresión. El casete del gen en el clon Gateway Entry se puede transferir de manera simple y eficiente a cualquier vector Gateway Destination (nomenclatura de Invitrogen para cualquier plásmido Gateway que contenga secuencias de recombinación Gateway “attR” y elementos tales como promotores y etiquetas de epítopos, pero no ORF ) usando el mezcla de enzimas patentada, “LR Clonase”. Se han creado miles de plásmidos Gateway Destination y se comparten libremente entre investigadores de todo el mundo. Los vectores Gateway Destination son similares a los vectores de expresión clásicos que contienen múltiples sitios de clonación, antes de la inserción de un gen de interés, utilizando digestión y ligación con enzimas de restricción. Los vectores de destino de puerta de enlace están disponibles comercialmente en Invitrogen, EMD ( Novagen ) y Covalys.
El tercer paso en la clonación de Gateway es la preparación para expresar el gen de interés. Asegúrese de utilizar una secuenciación o un resumen de restricción para comprobar la integridad de su clon de expresión. Una vez que su construcción esté funcionando, puede transformar o transfectar las células que desea emplear en sus investigaciones.
Dado que la clonación de Gateway utiliza secuencias de recombinación patentadas y mezclas de enzimas patentadas disponibles sólo en Invitrogen, la tecnología no permite a los investigadores cambiar de proveedor y contribuye al efecto de bloqueo de todos estos procedimientos patentados.
Para resumir los diferentes pasos involucrados en la clonación de Gateway:
Flexibilidad
Su secuencia de ADN de interés se puede mover a través de cualquier sistema de expresión en un solo paso de recombinación cuando crea el clon de entrada con ella.
Velocidad
En lugar de tomar dos o más días con la clonación por ligadura y restricción convencional, el enfoque Gateway permite la creación de la construcción de expresión en solo un día. Los productos attB-PCR también se pueden clonar inmediatamente en los vectores objetivo realizando las reacciones BP y LR en el mismo tubo. No existen procedimientos de restricción, ligación o purificación en gel durante el proceso de clonación.
Clonación de múltiples fragmentos
La clonación Gateway se puede utilizar para insertar simultáneamente varios fragmentos de ADN en numerosos vectores en un solo tubo. Para crear el clon de expresión necesario, se pueden clonar hasta cuatro segmentos de ADN en un único vector Gateway en un orden y orientación precisos en un solo tubo. El diseño de los vectores Gateway lo hace posible.
Alta eficiencia
El método de clonación Gateway utiliza marcadores de selección positivos y negativos para aumentar las posibilidades de clonar un gen con éxito. Esto significa que el proceso es más eficiente, lo que significa que es más probable que produzca resultados exitosos.
Universalidad
Se pueden clonar todo tipo de fragmentos de ADN mediante técnicas de PCR. La clonación está disponible para muchos tipos diferentes de organismos, desde mamíferos hasta bacterias.