La vía cGAS-STING es un componente del sistema inmunitario innato que funciona para detectar la presencia de ADN citosólico y, en respuesta, desencadenar la expresión de genes inflamatorios que pueden conducir a la senescencia [1] o a la activación de mecanismos de defensa. El ADN se encuentra normalmente en el núcleo de la célula. La localización del ADN en el citosol está asociada con la tumorigénesis , la infección viral y la invasión de algunas bacterias intracelulares. [2] La vía cGAS-STING actúa para detectar el ADN citosólico e inducir una respuesta inmunitaria.
Al unirse al ADN, la proteína GMP-AMP cíclico sintasa ( cGAS ) desencadena la reacción de GTP y ATP para formar GMP-AMP cíclico (cGAMP). El cGAMP se une al estimulador de genes de interferón ( STING ), que desencadena la fosforilación de IRF3 a través de TBK1 . A continuación, IRF3 puede dirigirse al núcleo para desencadenar la transcripción de genes inflamatorios. Esta vía desempeña un papel fundamental en la mediación de la defensa inmunitaria contra los virus de ADN bicatenario .
El sistema inmunitario innato depende de los receptores de reconocimiento de patrones (PRR) codificados en la línea germinal para reconocer patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) distintivos. Tras el reconocimiento de un PAMP, los PRR generan cascadas de señales que conducen a la transcripción de genes asociados con la respuesta inmunitaria. Debido a que todos los patógenos utilizan ácido nucleico para propagarse, los PRR pueden reconocer el ADN y el ARN para desencadenar la activación inmunitaria. En las células normales, el ADN está confinado al núcleo o mitocondria . La presencia de ADN en el citosol es indicativa de daño celular o infección y conduce a la activación de genes asociados con la respuesta inmunitaria. Una forma en que se detecta el ADN citosólico es a través de la vía cGAS/STING, específicamente por la sintasa de GMP-AMP cíclico (cGAS). Tras el reconocimiento del ADN, cGAS se dimeriza y estimula la formación de GMP-AMP cíclico (cGAMP). Luego, el cGAMP se une directamente al estimulador de genes de interferón (STING), que desencadena la fosforilación/activación del factor de transcripción IRF3 a través de TBK1. IRF3 puede ingresar al núcleo para promover la transcripción de genes inflamatorios, como IFN-β .
La cGAS es una proteína de 522 aminoácidos y miembro de la familia de las nucleotidiltransferasas . Los residuos N-terminales 1-212 son necesarios para la unión del dsADN. Esta región puede contener dos dominios de unión al ADN diferentes. Los residuos C-terminales 213-522 contienen parte del motivo de la nucleotidiltransferasa (NTasa) y un dominio Mab21 y están altamente conservados en la cGAS desde el pez cebra hasta los humanos. Estas regiones son necesarias para formar el bolsillo catalítico para los sustratos de la cGAS: GTP y ATP , y para realizar la reacción de ciclización necesaria. [3] [4] [5]
El cGAS se encuentra en la membrana plasmática [6] y es responsable de detectar el ADN bicatenario citosólico, que normalmente se encuentra en el núcleo celular, para estimular la producción de IFN-β. El cGAS también se encuentra en el núcleo, donde la estrecha unión a la cromatina impide su activación por el ADN propio. [7] Al unirse directamente al ADN citosólico, el cGAS forma dímeros para catalizar la producción de 2'3'-cGAMP a partir de ATP y GTP. El cGAMP actúa entonces como un segundo mensajero, uniéndose a STING, para desencadenar la activación del factor de transcripción IRF3. IRF3 conduce a la transcripción del IFN-β tipo 1. El cGAS no puede producir 2'3'-cGAMP en presencia de ARN.
Antes del descubrimiento de cGAS, se sabía que el interferón beta se producía en presencia de dsADN citosólico y que las células deficientes en STING no podían producir interferón en presencia de dsADN. Mediante el fraccionamiento bioquímico de extractos celulares y la espectrometría de masas cuantitativa, Sun et al. [8] identificaron a cGAS como la proteína sensora de ADN capaz de activar el interferón beta mediante la síntesis del segundo mensajero, 2'3'-cGAMP. Esta actividad depende del ADN citosólico.
El cGAS cataliza la formación de cGAMP en presencia de dsADN. El cGAS se une directamente al dsADN a través de residuos de aminoácidos cargados positivamente que interactúan con la cadena principal de fosfato del ADN cargada negativamente. Las mutaciones en los residuos cargados positivamente anulan por completo la unión al ADN y la posterior producción de interferón a través de STING. Al unirse al dsADN, el cGAS se dimeriza y sufre cambios conformacionales que abren un bolsillo de unión de nucleótidos catalíticos, lo que permite la entrada de GTP y ATP . Aquí se estabilizan a través del apilamiento de bases, enlaces de hidrógeno y cationes divalentes para catalizar la formación de enlaces fosfodiéster para producir el dinucleótido cíclico cGAMP.
El GMP-AMP cíclico (cGAMP) es un dinucleótido cíclico (CDN) y el primero que se encontró en los metazoos. Otros CDN (c-di-GMP y c-di-AMP) se encuentran comúnmente en bacterias, arqueas y protozoos. Como sugiere el nombre, el cGAMP es una molécula cíclica compuesta por un monofosfato de adenina (AMP) y un monofosfato de guanina (GMP) conectados por dos enlaces fosfodiéster. Sin embargo, el cGAMP se diferencia de otros CDN en que contiene un enlace fosfodiéster único entre el 2' OH del GMP y el fosfato 5' del AMP. [9] El otro enlace es entre el 3' OH del AMP y el fosfato 5' del GMP. El enlace fosfodiéster único 2'-5' puede ser ventajoso porque es menos susceptible a la degradación causada por las fosfodiesterasas 3'-5'. Otras ventajas del enlace único 2'-5' pueden ser que cGAMP es capaz de unirse a múltiples variantes alélicas de STING encontradas en la población humana, mientras que otras CDN, compuestas solo por enlaces 3'-5', no lo son.
El cGAMP fue descubierto por Zhijian "James" Chen y sus colegas [11] mediante la recolección de extractos citoplasmáticos de células transfectadas con diferentes tipos de ADN. Los extractos celulares se analizaron para la activación de STING mediante la detección de dímeros IRF3 activados. Mediante cromatografía de purificación por afinidad , se purificó la sustancia activadora de STING y se utilizó espectrometría de masas para identificar la sustancia como cíclico-GMP-AMP (cGAMP).
Se ha demostrado que el cGAMP sintetizado químicamente desencadena la activación de IRF3 y la producción de IFN-β. Se ha descubierto que el cGAMP es mucho más potente que otros dinucleótidos cíclicos (c-di-GMP y c-di-AMP). Se ha demostrado que el cGAMP se une definitivamente a STING mediante el uso de cGAMP radiomarcado reticulado a STING. Se ha descubierto que la adición de cGAMP no marcado, c-di-GMP o c-di-AMP compite con el cGAMP radiomarcado, lo que sugiere que los sitios de unión de CDN se superponen. Más tarde se ha demostrado que el cGAMP tiene un enlace fosfodiéster 2'-5' único, que difiere de los CDN convencionales unidos 3'-5' y que este enlace puede explicar algunas de las propiedades de señalización únicas del cGAMP. [9]
STING es una proteína residente en el retículo endoplásmico y se ha demostrado que se une directamente a una variedad de dinucleótidos cíclicos diferentes, como el monofosfato de adenosina-inosina cíclico . [9]
STING se expresa ampliamente en numerosos tipos de tejidos, tanto de origen inmune como no inmune. [12] STING se identificó en fibroblastos embrionarios murinos y es necesario para la respuesta del interferón tipo 1 tanto en células inmunes como no inmunes. [13]
STING es una proteína de 378 aminoácidos. Su región N-terminal (residuos 1-154) contiene cuatro dominios transmembrana. Su dominio C-terminal contiene el dominio de dimerización, el dominio de interacción de dinucleótidos cíclicos, así como un dominio responsable de interactuar y activar TBK1. Tras la unión de cGAMP 2'-3', STING sufre un cambio conformacional significativo (aproximadamente 20 Angstrom de rotación hacia adentro) que encierra a cGAMP.
Tras la unión de 2'-3' cGAMP (y otras CDN bacterianas), STING activa TBK1 para fosforilar los factores de transcripción descendentes IRF3, que induce la respuesta de IFN tipo 1, y STAT6 , que induce quimiocinas como CCL2 y CCL20 independientemente de IRF3. [15] También se cree que STING activa el factor de transcripción NF-κB a través de la actividad de la quinasa IκB (IKK), aunque el mecanismo de activación de NF-κB aguas abajo de STING aún está por determinar. Las vías de señalización activadas por STING se combinan para inducir una respuesta inmune innata a las células con ADN ectópico en el citosol. La pérdida de la actividad de STING inhibe la capacidad de los fibroblastos embrionarios de ratón para luchar contra la infección por ciertos virus y, de manera más general, es necesaria para la respuesta de IFN tipo 1 al ADN citosólico introducido. [13]
Se ha sugerido que el papel general de STING como molécula adaptadora en la respuesta del IFN de tipo 1 del ADN citosólico en distintos tipos de células funciona a través de las células dendríticas (CD). Las CD conectan el sistema inmunitario innato con el sistema inmunitario adaptativo a través de la fagocitosis y la presentación del antígeno extraño por el MHC . La respuesta del IFN de tipo 1 iniciada por las CD, tal vez a través del reconocimiento del ADN fagocitado, [16] tiene un importante efecto coestimulador. Esto ha llevado recientemente a la especulación de que el 2'-3' cGAMP podría utilizarse como un adyuvante más eficiente y directo que el ADN para inducir respuestas inmunitarias.
Se han encontrado variaciones naturales en el gen STING humano (hSTING) en la posición de aminoácidos 232 (R232 y H232). Las variantes H232 han disminuido las respuestas de IFN tipo 1 [17] y la mutación en esta posición de la alanina anula la respuesta a las CDN bacterianas. También se encontraron sustituciones que mejoran la unión del ligando. Se demostró que las sustituciones G230A aumentan la señalización hSTING tras la unión de c-di-GMP. Este residuo se encuentra en la tapa del bolsillo de unión, posiblemente aumentando la capacidad de unión de c-di-GMP. [18]
La vía cGAS-cGAMP-STING es capaz de generar interferón beta en respuesta al ADN citosólico. Se ha demostrado que los virus de ADN, como el HSV-1, son capaces de desencadenar la producción de cGAMP y la posterior activación del interferón beta a través de STING. Los virus de ARN, como el VSV o el virus Sendai , no pueden desencadenar la producción de interferón a través de cGAS-STING. Los ratones defectuosos en cGAS o STING no pueden producir interferón en respuesta a la infección por HSV-1, lo que finalmente conduce a la muerte, mientras que los ratones con función normal de cGAS y STING pueden recuperarse.
También se ha demostrado que los retrovirus, como el VIH-1, activan el IFN a través de la vía cGAS/STING. En estos estudios, los inhibidores de la transcripción inversa retroviral anularon la producción de IFN, lo que sugiere que es el ADNc viral el que activa el cGAS. [19]
La vía cGAS/STING también tiene un papel en la vigilancia tumoral. En respuesta al estrés celular, como el daño del ADN, las células regulan positivamente los ligandos NKG2D para que puedan ser reconocidos y destruidos por las células Natural Killer (NK) y T. En muchas células tumorales, la respuesta al daño del ADN es constitutivamente activa, lo que lleva a la acumulación de ADN citoplasmático. Esto activa la vía cGAS/STING que lleva a la activación de IRF3. Se demostró en células de linfoma que el ligando NKG2D, Rae1, se regulaba positivamente de una manera dependiente de STING/IRF3. La transfección de ADN en estas células también desencadenó la expresión de Rae1 que dependía de STING. En este modelo, el factor de transcripción IRF3, a través de cGAS/STING, regula positivamente los ligandos inducidos por estrés, como Rae1, en las células tumorales, para ayudar a la eliminación del tumor mediada por NK. [20] Además, se ha demostrado que la activación de la vía STING en los macrófagos de la médula ósea inhibe el crecimiento de células de leucemia mieloide aguda en modelos de ratones. [21]
El ADN citoplasmático, debido a una infección viral, puede provocar la activación del interferón beta para ayudar a eliminar la infección. Sin embargo, la activación crónica de STING, debido al ADN del huésped en el citosol, también puede activar la vía cGAS/STING, lo que conduce a trastornos autoinmunes. Un ejemplo de esto ocurre en el síndrome de Aicardi-Goutières (AGS). Las mutaciones en la exonucleasa de reparación 3', TREX1, hacen que los retroelementos endógenos se acumulen en el citosol, lo que puede conducir a la activación de cGAS/STING, lo que resulta en la producción de IFN. La producción excesiva de IFN conduce a un sistema inmunológico hiperactivo, lo que resulta en AGS y otros trastornos inmunológicos. En ratones, se encontró que los síntomas autoinmunes asociados con la deficiencia de TREX1 se aliviaron con la eliminación de cGAS, STING o IRF3, lo que implica la importancia de la detección de ADN aberrante en los trastornos autoinmunes. [19]
Se ha demostrado que la eliminación de cGAS y STING en fibroblastos embrionarios de ratón y en fibroblastos humanos primarios previene la senescencia y el establecimiento de SASP ( fenotipo secretor asociado a la senescencia ). [22] [1]
Se ha demostrado que el ADN es un potente adyuvante para potenciar la respuesta inmunitaria a los antígenos codificados por las vacunas. El cGAMP, a través de la activación de STING por IRF3, estimula la transcripción de interferón. Esto hace que el cGAMP sea un posible adyuvante de vacunas capaz de potenciar las respuestas inflamatorias. [9] Los estudios han demostrado que las vacunas codificadas con el antígeno de pollo, ovoalbúmina (OVA), junto con el cGAMP, pudieron activar las células T y B específicas del antígeno de una manera dependiente de STING in vivo. Cuando se estimularon con el péptido OVA, se demostró que las células T de ratones vacunados con OVA + cGAMP tenían niveles elevados de IFN-g e IL-2 en comparación con los animales que recibieron solo OVA. [23] Además, la estabilidad mejorada del cGAMP, debido al enlace fosfodiéster 2'-5' único, puede convertirlo en un adyuvante preferido para el ADN para aplicaciones in vivo.