La huella comunitaria es un conjunto de técnicas de biología molecular que se pueden utilizar para perfilar rápidamente la diversidad de una comunidad microbiana . En lugar de identificar o contar directamente células individuales en una muestra ambiental, estas técnicas muestran cuántas variantes de un gen están presentes. En general, se supone que cada variante genética diferente representa un tipo diferente de microbio. Los microbiólogos utilizan la huella comunitaria para estudiar una variedad de sistemas microbianos (por ejemplo, comunidades microbianas marinas, de agua dulce, del suelo y humanas) para medir la biodiversidad o rastrear cambios en la estructura de la comunidad a lo largo del tiempo. El método analiza muestras ambientales mediante el análisis de ADN genómico . Este enfoque ofrece una alternativa al cultivo microbiano , que es importante porque la mayoría de los microbios no se pueden cultivar en el laboratorio. [1] La huella comunitaria no da como resultado la identificación de especies de microbios individuales; en cambio, presenta una imagen general de una comunidad microbiana. Estos métodos ahora están siendo reemplazados en gran medida por la secuenciación de alto rendimiento, como el análisis de microbioma dirigido (por ejemplo, secuenciación de ARNr 16s) y la metagenómica .
Un análisis de huellas dactilares comienza con una muestra ambiental (por ejemplo, agua de mar o suelo), de la que se extrae el ADN total. (El ADN total contiene una mezcla de material genético de todos los microbios presentes en la muestra). Luego se selecciona un gen o región de ADN en particular como objetivo para el análisis, bajo el supuesto de que cada especie de microbio tendrá una variante genética diferente (también llamada " filotipo "). Se pueden utilizar diferentes métodos (ver a continuación) para visualizar los filotipos presentes en una muestra. Debido a que el objetivo de la huella de la comunidad es obtener una comprensión general de la estructura de la comunidad, es una técnica particularmente útil para analizar datos de series temporales recopilados en el campo. Por ejemplo, se podría estudiar el patrón de sucesión microbiana en un hábitat, o se podría examinar la respuesta de una comunidad microbiana a una perturbación ambiental, como la liberación de un contaminante. Dependiendo de la información que se desee, se pueden seleccionar diferentes genes. Los más comunes son los genes de ARN ribosómico de subunidad pequeña (ARNr), como el ARNr 16S . Estos genes se utilizan con frecuencia en los análisis filogenéticos microbianos , por lo que existen técnicas bien establecidas para su estudio. Otros genes de interés podrían ser aquellos que son clave en diversos procesos metabólicos. [1]
Las ventajas de la huella comunitaria son que se puede realizar de forma rápida y relativamente barata, y los análisis pueden dar cabida a una gran cantidad de muestras simultáneamente. [2] [3] Estas propiedades hacen que la huella comunitaria sea especialmente útil para monitorear los cambios en las comunidades microbianas a lo largo del tiempo. Además, las técnicas de huella comunitaria no requieren que uno tenga datos de secuencia a priori para los organismos en una muestra. Una desventaja de la huella comunitaria es que da como resultado datos en gran medida cualitativos, no cuantitativos. [4] Cuando se utilizan datos cualitativos, puede ser difícil comparar patrones observados en diferentes estudios o entre diferentes investigadores. Además, la huella comunitaria no identifica directamente los taxones en una muestra ambiental, aunque los datos resultantes de ciertas técnicas (por ejemplo, DGGE ) se pueden analizar más a fondo si se desea la identificación. Algunos autores señalan la escasa reproducibilidad de los resultados de ciertos métodos de huella, [3] mientras que otros autores han criticado la inexactitud de las estimaciones de abundancia y la incapacidad de algunas técnicas para capturar la presencia de taxones raros. [5] Por ejemplo, es difícil para el método DGGE detectar microbios que comprenden menos del 0,5%-1% de una comunidad bacteriana. [6]
En esta sección se presentan tres métodos de toma de huellas comunitarias.
El polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción terminal (T-RFLP) es un método que utiliza fragmentos de ADN marcados con fluorescencia para producir una huella de comunidad. [2] [7] Esta sección presenta una breve explicación del T-RFLP en el contexto específico de la huella de comunidad . Para una explicación más detallada, consulte el artículo T-RFLP .
Para realizar T-RFLP (Figura 1), se debe seleccionar un gen diana (por ejemplo, el gen 16S rRNA) para amplificar por PCR . Al menos un cebador utilizado en la reacción de PCR está marcado con fluorescencia en el extremo 5' . Después de la amplificación por PCR, cada segmento de ADN copiado lleva la etiqueta fluorescente. A continuación, se utilizan enzimas de restricción para cortar el ADN amplificado en sitios de reconocimiento específicos . La suposición subyacente es que cada microbio en la muestra tendrá una secuencia diferente en el gen diana, por lo que una enzima de restricción cortará el ADN de cada microbio en un lugar diferente. (Se considera que cada sitio de restricción diferente representa una única unidad taxonómica operativa [OTU]). Por lo tanto, la enzima producirá una longitud de fragmento para cada tipo de microbio presente en la muestra. El resultado de la digestión es un conjunto de fragmentos de restricción de diferentes longitudes, cada uno de los cuales está marcado con fluorescencia en un extremo. Estos se conocen como "fragmentos terminales" porque están marcados en el extremo donde se unió el cebador de PCR. (Los extremos no marcados no se registran en el análisis final). A continuación, los fragmentos se separan por tamaño mediante electroforesis capilar o en gel . La detección láser captura el tamaño y los patrones de intensidad de fluorescencia de los fragmentos terminales. Los estándares de ADN de tamaño y fluorescencia conocidos se incluyen en el análisis como referencias. Al establecer un umbral mínimo para la fluorescencia, se excluirá el ruido de fondo. [4]
El resultado del paso de detección láser es un electroferograma que muestra una serie de picos, con la longitud del fragmento en el eje horizontal y la intensidad de fluorescencia en el eje vertical (Figura 1). Un segundo resultado [4] es una tabla de datos que enumera el tiempo de migración de los fragmentos, el tamaño en pares de bases de cada pico y la altura y el área debajo de cada pico.
La base teórica de T-RFLP supone que los picos en diferentes posiciones a lo largo del eje horizontal representan diferentes tipos de organismos (u OTU). El área bajo cada pico de intensidad de fluorescencia es un indicador de la abundancia relativa de cada filotipo en la comunidad. Sin embargo, se deben tener en cuenta una serie de advertencias. Diferentes tipos de organismos pueden compartir un sitio de restricción en el gen de interés; si ese es el caso, estos organismos no se distinguirían como picos diferentes en el electroferograma. Además, el área bajo un pico representa la abundancia relativa en lugar de la abundancia absoluta, y existen sesgos en la medición de la abundancia y la amplificación por PCR. Por ejemplo, los organismos que son escasos en la muestra de ADN total original no se amplificarán lo suficiente como para ser detectados en el análisis final. [7] Esto conduce a una subestimación de la diversidad de la comunidad. Liu et al. [7] citan otros posibles factores que pueden distorsionar los resultados, incluidas "diferencias en el número de copias de genes entre especies y sesgos introducidos durante la lisis celular, la extracción de ADN y la amplificación por PCR" (p. 4521). Para aquellos que buscan información técnica detallada, Marsh [2] proporciona un catálogo de sesgos potenciales que podrían introducirse en cada paso del proceso T-RFLP.
Las principales ventajas del T-RFLP son que es rápido y puede adaptarse fácilmente a muchas muestras. [2] Además, el resultado visual simplifica la comparación de los patrones de estructura de la comunidad en diferentes muestras. Una desventaja es la naturaleza amplia y cualitativa de los datos de salida, que deben interpretarse teniendo en cuenta las advertencias anteriores. Además, la identificación directa de microbios en una muestra no es posible a través del T-RFLP.
Disayathanoowat et al. [8] utilizaron T-RFLP para evaluar la comunidad microbiana intestinal, o microbioma, en dos especies de abejas melíferas en Tailandia. Descubrieron que las dos especies albergan diferentes comunidades microbianas y que el microbioma cambia a lo largo de la vida de las abejas.
Joo et al. [9] probaron el T-RFLP como método para el monitoreo del fitoplancton. Los autores recolectaron muestras de agua ambiental de embalses en una serie temporal. Después de comparar las muestras con fragmentos de restricción terminal conocidos (de una base de datos construida a partir de cultivos), concluyeron que el T-RFLP se puede utilizar de manera efectiva como una técnica para monitorear los cambios en la comunidad de fitoplancton. Sin embargo, se encontró que las estimaciones de diversidad y abundancia eran menos precisas que las obtenidas mediante otros métodos.
La electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) es una técnica de identificación microbiana que separa amplicones de aproximadamente el mismo tamaño en función de las propiedades de la secuencia [1] (Figura 2). Estas propiedades determinan el umbral en el que el ADN se desnaturaliza. El gel DGGE utiliza un desnaturalizante de ADN en gradiente (una mezcla de urea y formamida) o un gradiente de temperatura lineal. [10] Cuando el fragmento alcanza su punto de fusión (umbral de suficiente desnaturalizante), deja de moverse. Esto se debe al hecho de que un ADN bicatenario parcialmente fundido ya no puede migrar a través del gel. [11] Se utiliza una pinza GC (aproximadamente 40 bases con alto contenido de GC) como cebador especial para anclar los fragmentos de PCR juntos una vez que se han desnaturalizado . [12]
Cada carril de un gel representa una comunidad microbiana. Las bandas compartidas entre las muestras tienen el mismo tamaño y están aproximadamente en la misma posición en el gel. Las variantes genéticas que no se comparten entre las muestras de la comunidad microbiana no coinciden horizontalmente con otras. Por ejemplo, si el gen de interés es el ARNr 16S, como lo era cuando se describió la técnica por primera vez, los fragmentos amplificados por PCR estarán en la misma ubicación vertical porque todos tienen aproximadamente el mismo tamaño. [13] Otro gen objetivo puede tener una mayor variación en longitud, pero el gradiente desnaturalizante utiliza un segundo elemento (el punto de fusión) para distinguir aún más entre las muestras. El gel DGGE separará los genes del mismo tamaño en función de la secuencia de bases.
Esta técnica muestra en qué medida las comunidades microbianas son iguales o diferentes en su composición taxonómica. Cada banda en una ubicación diferente en el gel representa un filotipo diferente (una secuencia única de un gen marcador filogenético). [1] Para las comunidades microbianas, este método perfila muchas secuencias individuales de ARNr 16S. [14] La cantidad de bandas en diferentes posiciones horizontales se puede utilizar para estimar el nivel de biodiversidad en esa muestra e inferir la afiliación filogenética. [10] Para saber más sobre la afiliación filogenética, se podrían extirpar esas bandas del gel y luego secuenciarlas.
El uso de un perfil desnaturalizante sirve como una forma de separar fragmentos de ADN de tamaños similares. Esto es beneficioso para evaluar la diversidad microbiana debido al hecho de que el gen 16S rRNA no varía mucho en tamaño entre filos bacterianos. El gel DGGE proporciona una forma rápida de observar la biodiversidad en una muestra microbiana y no excluye la opción de secuenciar las bandas de interés. Este método no requiere que los microbios se cultiven en el laboratorio y no requiere ningún dato de secuencia necesario para diseñar sondas para métodos de hibridación. [10] La principal desventaja es que se trata de una evaluación cualitativa de la biodiversidad y uno debe secuenciar los genes para poder hacer inferencias sobre la relación filogenética. Otra desventaja es que la pinza GC puede ser variable cada vez que se sintetiza. Esto conduce a la posibilidad de diferentes perfiles DGGE para la misma secuencia 16S rRNA. [12]
Stephen et al. [15] utilizaron DGGE para un análisis rápido de Proteobacteria en el suelo. Obtuvieron una evaluación inicial de la diversidad microbiana en sus muestras ambientales de suelo mantenido durante 36 años a los distintos valores de pH. Combinaron DGGE y técnicas de hibridación mediante el sondeo de los fragmentos de ADN para obtener más detalles sobre las poblaciones naturales. En este estudio, estaban observando un grupo de tipos bacterianos estrechamente relacionados, todos oxidantes de amoníaco β–proteobacterianos autótrofos. Las muestras de ADNr 16S produjeron bandas superpuestas ambiguas cuando se las colocó en un gel. Las bandas superpuestas ambiguas se separaron con sondas radiomarcadas específicas del grupo, que arrojaron información sobre la abundancia relativa de los diferentes genotipos en las muestras.
Ward et al. [14] examinaron las comunidades de esteras de cianobacterias en una fuente termal de Yellowstone mediante el uso del análisis DGGE de segmentos del gen 16S rRNA de poblaciones aeróbicas quimioorganotróficas. La DGGE les permitió perfilar la comunidad y obtener nuevos conocimientos sobre la diversidad. Caracterizaron las bandas de interés mediante la purificación y secuenciación y detectaron muchos linajes cuya presencia se desconocía previamente.
El análisis (automatizado) de espaciadores intergénicos ribosomales , o (A)RISA (Figura 3), aprovecha el hecho de que el ADN procariota codifica dos genes altamente conservados, el gen 16SrRNA y el gen 23SrRNA. Estos codifican los genes de las subunidades pequeña y grande en el operón ARNr. Entre estos dos genes, hay una región espaciadora transcrita interna (ITS). Debido a que no codifica proteínas, es una secuencia y longitud de nucleótidos altamente variables. Una vez que el ADN se aísla de una comunidad, la PCR amplifica esta región espaciadora. Los fragmentos se pueden extraer en un gel (RISA), o los cebadores fluorescentes se pueden traducir en picos en abundancia de las diferentes longitudes de fragmentos en un electroferograma (ARISA). [16] [17]
Debido a las regiones variables no codificantes, la salida para RISA es un gel con diferentes patrones de bandas, y la salida para ARISA es un electroferograma con diferentes picos (similar a T-RFLP).
El brillo de los cebadores marcados con fluorescencia se correlaciona con la prevalencia de ese tipo bacteriano en la comunidad. El patrón de bandas en el gel se puede interpretar como un perfil específico de la comunidad. Cada banda o pico de ADN indica al menos un representante de ese organismo. [16] En RISA, las bandas en el gel que no coinciden en longitud representan diferentes organismos en la comunidad porque tienen diferentes regiones espaciadoras entre los dos genes altamente conservados. El electroferograma muestra picos que se correlacionan con la abundancia relativa de esa región espaciadora en la muestra.
ARISA puede tener una resolución más alta en la detección de diversidad microbiana en comparación con T-RFLP . [18] Este método de huellas dactilares es un método rápido y sensible para estimar la diversidad microbiana. Las heterogeneidades de longitud observadas se pueden comparar con bases de datos para la superposición con organismos cultivables. [16] Se pueden diseñar cebadores de oligonucleótidos a nivel de filo para llegar a preguntas sobre grupos filogenéticos. [16] Una desventaja de ARISA es el hecho de que un solo organismo puede contribuir con más de un pico al perfil de la comunidad. Los organismos no relacionados también pueden tener longitudes de espaciador similares, lo que conduce a subestimaciones de la diversidad de la comunidad. Debido a estos sesgos, los investigadores a menudo utilizan este método en múltiples muestras de cada comunidad para obtener una evaluación promedio.
Ranjard et al. [17] analizan varios ejemplos de tipos de estudios en los que se puede utilizar RISA. Citan varios estudios que han utilizado esta técnica para identificar comunidades bacterianas tras perturbaciones como el tratamiento con antibióticos, el estrés por mercurio y la deforestación. También demostraron el uso exitoso de ARISA para caracterizar comunidades fúngicas, que es un aspecto de la ecología microbiana que aún no se ha explorado por completo.
Schloss et al. [19] realizaron un estudio en el que examinaron las variables ambientales y las relacionaron con los cambios en la ecología microbiana de una pila de compost. Utilizaron ARISA para perfilar la estructura de la comunidad y observar la sucesión microbiana a lo largo de las etapas del proceso de compostaje. Tomaron muestras de ADN y secuenciaron el gen 16S rRNA para identificar a los miembros de la comunidad en las diferentes fases del proceso. Luego utilizaron ARISA para observar los cambios en toda la comunidad y luego combinaron la secuencia del gen 16S rRNA con los fragmentos ARISA más comunes para identificar a estos miembros de la comunidad microbiana.