La cuantificación sin etiquetas es un método de espectrometría de masas que tiene como objetivo determinar la cantidad relativa de proteínas en dos o más muestras biológicas . A diferencia de otros métodos para la cuantificación de proteínas , la cuantificación sin etiquetas no utiliza un compuesto que contenga un isótopo estable para unirse químicamente a la proteína y así etiquetarla. [1] [2]
La cuantificación sin etiquetas puede basarse en la intensidad de la señal precursora o en el recuento espectral . El primer método es útil cuando se aplica a espectros de masas de alta precisión, como los obtenidos utilizando la nueva generación de analizadores de masas de tiempo de vuelo (ToF), resonancia de ciclotrón de iones por transformada de Fourier (FTICR) o Orbitrap . La potencia de alta resolución facilita la extracción de señales peptídicas en el nivel MS 1 y, por lo tanto, desacopla la cuantificación del proceso de identificación. Por el contrario, el recuento espectral simplemente cuenta el número de espectros identificados para un péptido determinado en diferentes muestras biológicas y luego integra los resultados de todos los péptidos medidos de las proteínas que se cuantifican.
El marco computacional del enfoque sin etiquetas incluye la detección de péptidos, la comparación de los péptidos correspondientes en múltiples datos de LC-MS y la selección de péptidos discriminatorios. [3] [4]
La espectrometría de expresión de proteínas intactas (IPEx) es un enfoque de cuantificación sin etiquetas en espectrometría de masas que está desarrollando el grupo de química analítica del Centro de Seguridad Alimentaria y Nutrición Aplicada de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos y otros lugares. Las proteínas intactas se analizan mediante un instrumento LCMS , generalmente un tiempo de vuelo cuadrupolo en modo de perfil, y el perfil de proteína completo se determina y cuantifica utilizando un software de reducción de datos. Los primeros resultados son muy alentadores. En un estudio, dos grupos de réplicas de tratamiento de muestras de mamíferos (organismos diferentes con historiales de tratamiento similares, pero no réplicas técnicas) muestran docenas de biomarcadores de proteína CV bajos, lo que sugiere que IPEx es una tecnología viable para estudiar la expresión de proteínas. [5]
Normalmente, las señales peptídicas se detectan en el nivel MS1 y se distinguen del ruido químico mediante su patrón isotópico característico. Luego se rastrean estos patrones a lo largo de la dimensión del tiempo de retención y se usan para reconstruir un perfil de elución cromatográfica de la masa peptídica monoisotópica. Luego se integra la corriente iónica total de la señal peptídica y se utiliza como medida cuantitativa de la concentración peptídica original. Para cada péptido detectado, primero se encuentran todos los picos isotópicos y luego se asigna el estado de carga.
La cuantificación sin etiquetas puede basarse en la intensidad de la señal del precursor y tiene problemas debido a la interferencia del aislamiento: en estudios de alto rendimiento, la identidad del ion precursor del péptido que se está midiendo podría ser fácilmente un péptido completamente diferente con una relación m/z similar y que eluye en un marco de tiempo que se superpone con el del péptido anterior. El conteo espectral tiene problemas debido al hecho de que los péptidos están identificados, por lo que es necesario ejecutar una exploración MS/MS adicional que lleva tiempo y, por lo tanto, reduce la resolución del experimento.
A diferencia del etiquetado diferencial, en un experimento sin etiquetas es necesario medir cada muestra biológica por separado. Luego, las señales peptídicas extraídas se asignan a través de pocas o múltiples mediciones de LC-MS utilizando sus coordenadas en las dimensiones de masa a carga y tiempo de retención. Los datos de instrumentos de precisión de gran masa facilitan enormemente este proceso y aumentan la certeza de hacer coincidir las señales peptídicas correctas en todas las ejecuciones.
Claramente, el procesamiento diferencial de muestras biológicas hace necesario disponer de un estándar que pueda utilizarse para ajustar los resultados. Para este fin se pueden utilizar péptidos cuyos niveles de expresión no se espera que cambien en diferentes muestras biológicas. Sin embargo, no todos los péptidos se ionizan bien y por tanto la elección de los candidatos debe realizarse tras un estudio inicial que sólo debe caracterizar el contenido proteico de las muestras biológicas que serán investigadas.
Finalmente, se utilizan métodos de normalización sofisticados para eliminar artefactos sistemáticos en los valores de intensidad de péptidos entre las mediciones de LC-MS. Luego, los péptidos discriminatorios se identifican seleccionando los péptidos cuyas intensidades normalizadas son diferentes (p. ej., valor de p <0,05) entre múltiples grupos de muestras.
Además, los espectrómetros de masas híbridos más nuevos, como LTQ OrbiTrap, ofrecen la posibilidad de adquirir identificaciones de péptidos MS/MS en paralelo a la medición de alta precisión de masas de péptidos en el nivel MS1. Esto plantea el desafío computacional para el procesamiento y la integración de estas dos fuentes de información y ha llevado al desarrollo de novedosas y prometedoras estrategias de cuantificación.