En biología molecular , la subclonación es una técnica utilizada para mover una secuencia de ADN particular de un vector principal a un vector de destino .
La subclonación no debe confundirse con la clonación molecular , una técnica relacionada.
Las enzimas de restricción se utilizan para eliminar el gen de interés (el inserto ) del padre. El inserto se purifica para aislarlo de otras moléculas de ADN. Un método de purificación común es el aislamiento en gel . Luego, el número de copias del gen se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Al mismo tiempo, se utilizan las mismas enzimas de restricción para digerir (cortar) el destino. La idea detrás del uso de las mismas enzimas de restricción es crear extremos adhesivos complementarios , que facilitarán la ligadura más adelante. También se agrega una fosfatasa , comúnmente fosfatasa alcalina intestinal de ternera (CIAP), para evitar la autoligación del vector de destino. El vector de destino digerido se aísla/purifica.
Luego, el inserto y el vector de destino se mezclan con ADN ligasa. Una relación molar típica entre genes de inserción y vectores de destino es 3:1; [1] al aumentar la concentración del inserto, la autoligación disminuye aún más. Después de dejar reposar la mezcla de reacción durante un período de tiempo determinado a una temperatura específica (dependiendo del tamaño de las hebras que se ligan; para obtener más información, consulte ADN ligasa ), el inserto debería incorporarse con éxito al plásmido de destino .
El plásmido suele transformarse en una bacteria como E. coli . Idealmente, cuando la bacteria se divide, el plásmido también debería replicarse. En el mejor de los casos, cada célula bacteriana debería tener varias copias del plásmido. Una vez que haya crecido un buen número de colonias bacterianas, se pueden minipreparar para recolectar el ADN plasmídico.
Para garantizar el crecimiento únicamente de bacterias transformadas (que portan los plásmidos que se desean recolectar), se utiliza un gen marcador en el vector de destino para la selección . Los genes marcadores típicos son los de resistencia a antibióticos o biosíntesis de nutrientes . Así, por ejemplo, el "gen marcador" podría ser el de la resistencia al antibiótico ampicilina. Si las bacterias que debían captar el plásmido deseado hubieran captado el gen deseado, entonces también contendrían el "gen marcador". Ahora, las bacterias que recogieron el plásmido podrían crecer en ampicilina, mientras que las bacterias que no recogieron el plásmido deseado seguirían siendo vulnerables a la destrucción por la ampicilina. Por lo tanto, las bacterias transformadas con éxito serían "seleccionadas".
En este ejemplo, un gen de una biblioteca de genes de mamíferos se subclonará en un plásmido bacteriano (plataforma de destino). El plásmido bacteriano es un trozo de ADN circular que contiene elementos reguladores que permiten a las bacterias producir un producto genético ( expresión genética ) si se coloca en el lugar correcto del plásmido. El sitio de producción está flanqueado por dos sitios de corte de enzimas de restricción "A" y "B" con extremos pegajosos incompatibles.
El ADN de los mamíferos no viene con estos sitios de restricción, por lo que se incorporan mediante PCR de extensión superpuesta . Los cebadores están diseñados para colocar los sitios de restricción con cuidado, de modo que la codificación de la proteína esté dentro del marco y se implante un mínimo de aminoácidos adicionales a cada lado de la proteína.
Tanto el producto de la PCR que contiene el gen de mamífero con los nuevos sitios de restricción como el plásmido de destino se someten a digestión de restricción, y los productos de la digestión se purifican mediante electroforesis en gel .
Los productos de digestión, que ahora contienen extremos pegajosos compatibles entre sí (pero extremos pegajosos incompatibles entre sí) se someten a ligación, creando un nuevo plásmido que contiene los elementos de fondo del plásmido original con un inserto diferente.
El plásmido se transforma en bacteria y la identidad del inserto se confirma mediante secuenciación del ADN .