En biología molecular , la subclonación es una técnica utilizada para trasladar una secuencia de ADN particular de un vector original a un vector de destino .
La subclonación no debe confundirse con la clonación molecular , una técnica relacionada.
Las enzimas de restricción se utilizan para extraer el gen de interés (el inserto ) del gen original. El inserto se purifica para aislarlo de otras moléculas de ADN. Un método de purificación común es el aislamiento en gel . Luego, se amplifica el número de copias del gen mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Simultáneamente, se utilizan las mismas enzimas de restricción para digerir (cortar) el vector de destino. La idea detrás del uso de las mismas enzimas de restricción es crear extremos cohesivos complementarios , que facilitarán la ligadura más adelante. También se agrega una fosfatasa , comúnmente fosfatasa alcalina intestinal de ternera (CIAP), para evitar la autoligación del vector de destino. El vector de destino digerido se aísla/purifica.
El inserto y el vector de destino se mezclan luego con la ADN ligasa. Una proporción molar típica de genes de inserto a vectores de destino es 3:1; [1] al aumentar la concentración del inserto, la autoligación disminuye aún más. Después de dejar reposar la mezcla de reacción durante un tiempo determinado a una temperatura específica (dependiendo del tamaño de las hebras que se están ligando; para obtener más información, consulte la ADN ligasa ), el inserto debería incorporarse con éxito al plásmido de destino .
El plásmido se transforma a menudo en una bacteria como E. coli . Lo ideal es que, cuando la bacteria se divide, el plásmido también se replique. En el mejor de los casos, cada célula bacteriana debería tener varias copias del plásmido. Una vez que haya crecido una buena cantidad de colonias bacterianas, se pueden preparar en minipreparación para recolectar el ADN del plásmido.
Para asegurar el crecimiento de sólo bacterias transformadas (que portan los plásmidos deseados que se van a recolectar), se utiliza un gen marcador en el vector de destino para la selección . Los genes marcadores típicos son para la resistencia a los antibióticos o la biosíntesis de nutrientes . Así, por ejemplo, el "gen marcador" podría ser para la resistencia al antibiótico ampicilina. Si las bacterias que se supone que deben recoger el plásmido deseado hubieran recogido el gen deseado, entonces también contendrían el "gen marcador". Ahora, las bacterias que recogieron el plásmido podrían crecer en ampicilina, mientras que las bacterias que no recogieron el plásmido deseado seguirían siendo vulnerables a la destrucción por la ampicilina. Por lo tanto, las bacterias transformadas con éxito serían "seleccionadas".
En este ejemplo, un gen de una biblioteca de genes de mamíferos se subclonará en un plásmido bacteriano (plataforma de destino). El plásmido bacteriano es un fragmento de ADN circular que contiene elementos reguladores que permiten que la bacteria produzca un producto génico ( expresión génica ) si se coloca en el lugar correcto en el plásmido. El sitio de producción está flanqueado por dos sitios de corte de enzimas de restricción "A" y "B" con extremos cohesivos incompatibles.
El ADN de los mamíferos no tiene estos sitios de restricción, por lo que se incorporan mediante PCR de extensión superpuesta . Los cebadores están diseñados para colocar los sitios de restricción con cuidado, de modo que la codificación de la proteína esté en el marco y se implante un mínimo de aminoácidos adicionales en cada lado de la proteína.
Tanto el producto de PCR que contiene el gen de mamífero con los nuevos sitios de restricción como el plásmido de destino se someten a digestión de restricción, y los productos de la digestión se purifican mediante electroforesis en gel .
Los productos de la digestión, que ahora contienen extremos adhesivos compatibles entre sí (pero extremos adhesivos incompatibles entre sí), se someten a ligadura, creando un nuevo plásmido que contiene los elementos de fondo del plásmido original con un inserto diferente.
El plásmido se transforma en bacteria y la identidad del inserto se confirma mediante secuenciación de ADN .