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Mutagénesis de saturación

Mutagénesis de saturación de una única posición en una proteína teórica de 10 residuos. La versión de tipo salvaje de la proteína se muestra en la parte superior, donde M representa el primer aminoácido metionina y * representa la terminación de la traducción. Los 19 mutantes en la posición 5 se muestran a continuación.

La mutagénesis de saturación del sitio (SSM) , o simplemente saturación del sitio , es una técnica de mutagénesis aleatoria utilizada en ingeniería de proteínas , en la que un solo codón o conjunto de codones se sustituye con todos los aminoácidos posibles en la posición. [1] Hay muchas variantes de la técnica de saturación del sitio, desde la saturación del sitio pareada (saturar dos posiciones en cada mutante de la biblioteca) hasta la saturación del sitio de escaneo (realizar una saturación del sitio en cada sitio de la proteína, lo que da como resultado una biblioteca de tamaño [20^(número de residuos en la proteína)] que contiene todos los posibles mutantes puntuales de la proteína).

Método

Representación de una forma habitual de clonar una biblioteca de mutagénesis dirigida (es decir, utilizando oligos degenerados). El gen de interés se somete a PCR con oligos que contienen una región que es perfectamente complementaria a la plantilla (azul) y una que difiere de la plantilla en uno o más nucleótidos (rojo). Muchos de estos cebadores que contienen degeneración en la región no complementaria se agrupan en la misma PCR, lo que da como resultado muchos productos de PCR diferentes con diferentes mutaciones en esa región (los mutantes individuales se muestran con diferentes colores a continuación).

La mutagénesis de saturación se logra comúnmente mediante mutagénesis dirigida por PCR con un codón aleatorio en los cebadores (por ejemplo, SeSaM ) [2] o mediante síntesis genética artificial , con una mezcla de nucleótidos de síntesis utilizados en los codones que se van a aleatorizar. [3]

Se pueden utilizar diferentes codones degenerados para codificar conjuntos de aminoácidos. [1] Debido a que algunos aminoácidos están codificados por más codones que otros, la proporción exacta de aminoácidos no puede ser igual. Además, es habitual utilizar codones degenerados que minimicen los codones de terminación (que generalmente no son deseados). En consecuencia, el 'NNN' completamente aleatorio no es ideal y se utilizan codones degenerados alternativos más restringidos. 'NNK' y 'NNS' tienen el beneficio de codificar los 20 aminoácidos, pero aún codifican un codón de terminación el 3% del tiempo. Los codones alternativos como 'NDT', 'DBK' evitan los codones de terminación por completo y codifican un conjunto mínimo de aminoácidos que aún abarcan todos los tipos biofísicos principales (aniónico, catiónico, alifático hidrófobo, aromático hidrófobo, hidrófilo, pequeño). [1] En el caso de que no haya restricción para usar un solo codón degenerado, es posible reducir el sesgo considerablemente. [4] [5] Se desarrollaron varias herramientas computacionales para permitir un alto nivel de control sobre los codones degenerados y sus aminoácidos correspondientes. [6] [7] [8]

Aplicaciones

La mutagénesis de saturación se utiliza comúnmente para generar variantes para la evolución dirigida . [9] [10]

Véase también

Referencias

  1. ^ abc Reetz, MT; Carballeira JD (2007). "Mutagénesis de saturación iterativa (ISM) para la rápida evolución dirigida de enzimas funcionales". Nature Protocols . 2 (4): 891–903. doi :10.1038/nprot.2007.72. PMID  17446890. S2CID  37361631.
  2. ^ Zheng, Lei; Baumann, Ulrich; Reymond, Jean-Louis (15 de julio de 2004). "Un protocolo eficiente de mutagénesis dirigida al sitio y de saturación del sitio en un solo paso". Investigación de ácidos nucleicos . 32 (14): e115. doi :10.1093/nar/gnh110. ISSN  0305-1048. PMC 514394 . PMID  15304544. 
  3. ^ Reetz, Manfred T.; Prasad, Shreenath; Carballeira, José D.; Gumulya, Yosephine; Bocola, Marco (7 de julio de 2010). "La mutagénesis de saturación iterativa acelera la evolución en el laboratorio de la estereoselectividad enzimática: comparación rigurosa con los métodos tradicionales". Revista de la Sociedad Química Americana . 132 (26): 9144–9152. doi :10.1021/ja1030479. ISSN  0002-7863. PMID  20536132.
  4. ^ Kille, Sabrina; Acevedo-Rocha, Carlos G.; Parra, Loreto P.; Zhang, Zhi-Gang; Opperman, Diederik J.; Reetz, Manfred T.; Acevedo, Juan Pablo (15 de febrero de 2013). "Reducción de la redundancia de codones y esfuerzo de selección de bibliotecas de proteínas combinatorias creadas mediante mutagénesis de saturación". ACS Synthetic Biology . 2 (2): 83–92. doi :10.1021/sb300037w. PMID  23656371.
  5. ^ Tang, Lixia; Wang, Xiong; Ru, Beibei; Sun, Hengfei; Huang, Jian; Gao, Hui (junio de 2014). "MDC-Analyzer: una nueva herramienta de diseño de cebadores degenerados para la construcción de bibliotecas de mutagénesis inteligentes con sitios contiguos". BioTechniques . 56 (6): 301–302, 304, 306–308, passim. doi : 10.2144/000114177 . ISSN  1940-9818. PMID  24924390.
  6. ^ Halweg-Edwards, Andrea L.; Pines, Gur; Winkler, James D.; Pines, Assaf; Gill, Ryan T. (16 de septiembre de 2016). "Una interfaz web para la compresión de codones". ACS Synthetic Biology . 5 (9): 1021–1023. doi :10.1021/acssynbio.6b00026. ISSN  2161-5063. PMID  27169595.
  7. ^ Engqvist, Martin KM; Nielsen, Jens (30 de abril de 2015). "ANT: software para generar y evaluar codones degenerados para códigos genéticos naturales y expandidos". ACS Synthetic Biology . 4 (8): 935–938. doi :10.1021/acssynbio.5b00018. PMID  25901796.
  8. ^ Kell, Douglas B.; Day, Philip J.; Breitling, Rainer; Green, Lucy; Currin, Andrew; Swainston, Neil (10 de julio de 2017). "CodonGenie: herramientas optimizadas para el diseño de codones ambiguos". PeerJ Computer Science . 3 : e120. doi : 10.7717/peerj-cs.120 . ISSN  2376-5992.
  9. ^ Chica, Robert A.; et al. (2005). "Enfoques semirracionales para la ingeniería de la actividad enzimática: combinando los beneficios de la evolución dirigida y el diseño racional". Current Opinion in Biotechnology . 16 (4): 378–384. doi :10.1016/j.copbio.2005.06.004. PMID  15994074.
  10. ^ Shivange, Amol V; Marienhagen, Jan; Mundhada, Hemanshu; Schenk, Alexander; Schwaneberg, Ulrich (1 de febrero de 2009). "Avances en la generación de diversidad funcional para la evolución dirigida de proteínas". Current Opinion in Chemical Biology . Biocatálisis y biotransformación/Química bioinorgánica. 13 (1): 19–25. doi :10.1016/j.cbpa.2009.01.019. PMID  19261539.