La secuenciación magnética es un método de secuenciación de moléculas individuales en desarrollo. Una horquilla de ADN , que contiene la secuencia de interés, se une entre una perla magnética y una superficie de vidrio. Se aplica un campo magnético para estirar la horquilla y abrirla en hebras individuales, y la horquilla se pliega nuevamente después de disminuir el campo magnético. La longitud de la horquilla se puede determinar mediante la obtención de imágenes directas de los anillos de difracción de las perlas magnéticas utilizando un microscopio simple. Las secuencias de ADN se determinan midiendo los cambios en la longitud de la horquilla después de una hibridación exitosa de nucleótidos complementarios. [1]
Con el desarrollo de varias plataformas de secuenciación de próxima generación , ha habido una reducción sustancial en los costos y un aumento en el rendimiento de la secuenciación de ADN. Sin embargo, la mayoría de las tecnologías de secuenciación se basan en la amplificación clonal basada en PCR de la molécula de ADN para llevar la señal a un rango detectable. [2] La secuenciación de grupos amplificados, o la secuenciación en masa, en este caso, plantea un problema de fase dependiente de la longitud de lectura. Durante cada ciclo, no todas las moléculas dentro de la masa tienen una incorporación exitosa de un nucleótido adicional. Con un ciclo de secuenciación aumentado, la señal de las moléculas rezagadas eventualmente abrumará la señal verdadera. El problema de la fase es una limitación importante para las longitudes de lectura de las tecnologías de secuenciación de próxima generación. Por lo tanto, existe un mayor interés en el desarrollo de tecnologías de secuenciación de una sola molécula, donde no se requiere amplificación. Esto no solo acorta el tiempo de preparación para las bibliotecas de secuenciación, sino que también tiene el potencial de lograr longitudes de lectura mucho más largas, ya que las moléculas rezagadas con extensiones fallidas se pueden ignorar o considerar por separado. Las tecnologías de secuenciación de moléculas individuales conocidas anteriormente incluyen la secuenciación Nanopore (Oxford Nanopore), [3] la secuenciación SMRT ( Pacific Biosciences ), [4] y la secuenciación de moléculas individuales Heliscope ( Helicos Biosciences ). [5]
La molécula de ADN de interés debe incorporarse en una horquilla y unirse a una perla magnética en un extremo y a una superficie de vidrio inmóvil en el otro extremo. La horquilla se une a la superficie de vidrio a través de un enlace digoxigenina -antidigoxigenina. [1] La perla magnética se une al extremo opuesto a través de la interacción biotina - estreptavidina . [1] Esta configuración de horquilla de ADN se puede realizar de dos maneras:
Se colocan electroimanes sobre el portaobjetos de muestra [6] y un microscopio invertido debajo [7] . La imagen se captura mediante una cámara CCD y se transfiere a una computadora, donde se determinan las posiciones tridimensionales de las perlas magnéticas. La posición de la perla dentro del plano horizontal del portaobjetos de vidrio, x e y, se determinan mediante la correlación en tiempo real de las imágenes de las perlas [8] . La longitud vertical de la horquilla, medida por la posición vertical de la perla magnética adjunta, se mide por el diámetro del anillo de difracción de la perla, que aumenta con la distancia [7] .
Se aplica una fuerza magnética constante para abrir la horquilla de ADN y, al reducir la fuerza, la horquilla se puede volver a cerrar. [9] Antes de realizar las aplicaciones posteriores, se realizan varios ciclos de apertura y cierre. Si bien la fuerza magnética necesaria para abrir y cerrar puede variar según la secuencia de ADN y la longitud de la horquilla, sus valores absolutos no son críticos siempre que sean constantes dentro de una serie de secuenciación. [1]
Cuando la horquilla de ADN se descomprime en una sola hebra, los oligonucleótidos complementarios a la secuencia de la horquilla pueden hibridarse. Durante el transcurso del proceso de recompresión, los oligonucleótidos unidos causan bloqueos transitorios. [1] La medición de la longitud de la horquilla a lo largo del tiempo permite determinar la posición exacta de la hibridación, así como la presencia de desajustes entre el oligonucleótido y la horquilla. [1]
La hibridación es una forma de determinar la secuencia de una cadena de ADN a partir de la detección de los cambios en la longitud de una horquilla. Cuando una sonda se hibrida con una horquilla abierta, se detiene el replegamiento completo de la horquilla y se puede inferir la posición de la sonda hibridada. De este modo, la secuencia de un fragmento de ADN de interés se puede inferir a partir de la superposición de las posiciones de los conjuntos de sondas, a las que se les permite hibridarse una por una. [10]
En primer lugar, un fragmento de ADN se puede convertir en una nueva secuencia en la que cada nucleótido original está codificado por una secuencia específica de 8 nt (A8, T8, G8 y C8) [11] y luego ligado a una horquilla.
Después de aplicar una fuerza magnética, en el estado descomprimido de la horquilla, una pequeña cantidad de nucleótidos discriminantes pueden hibridarse con las nuevas secuencias complementarias individuales en la horquilla, lo que puede bloquear transitoriamente el plegamiento de la horquilla.
La identificación de las posiciones de bloqueo de la horquilla producidas por la hibridación de los nucleótidos discriminantes se puede observar como pausas en el transcurso del tiempo de la medición de la distancia de la horquilla. La secuencia completa se puede reconstruir a partir de los fragmentos superpuestos.
Otra aplicación de la secuenciación magnética es el uso de la distancia de extremo a extremo de la horquilla para detectar la ligadura sucesiva de oligonucleótidos. [12] El primer paso de la secuenciación por ligadura es el uso de un cebador para extender un fragmento de ADN. La extensión se intenta primero con un fragmento que comienza con adenina, que solo se puede ligar si el siguiente nucleótido en la cadena opuesta es una timina. Luego se intentan los fragmentos que comienzan con citosina, guanina y timina, uno por uno, y el ciclo se repite. El campo magnético se libera después de cada ligadura y luego se mide la longitud del cebador extendido. Tras la ligadura, el cebador se extiende siete bases, lo que da como resultado un aumento detectable en la distancia de extremo a extremo de la horquilla. La escisión de la ARNasa en la posición 2 es seguida por la ligadura para la preparación del siguiente ciclo de ligadura, de modo que la siguiente ligadura se coloca justo delante de la anterior. [10]
La biblioteca de cebadores de 7 nt, 5′-NNNNNNrX-3′, se utiliza en la ligación de una fragmentina de oligonucleótido degenerado corto, en la que N representa cualquiera de los cuatro desoxirribonucleótidos y Nr representa cualquiera de los cuatro ribonucleótidos , X es la base probada (A, G, C, T). Se prueba la ligación a una cadena de cebadores de cada una de las cuatro bases probadas en ciclos de apertura y cierre de horquilla. [1]
El cebador de 7 nt se liga en el estado abierto de la horquilla, lo que bloqueará la recompresión de los últimos siete nucleótidos y aumentará la distancia entre la superficie y la perla magnética en ~5 nm. [1] Si la ligadura no es exitosa, no se observa ningún cambio en la longitud de la horquilla.
La escisión de los últimos seis nucleótidos por la ARNasa es el siguiente paso después de la ligadura, que en última instancia extiende la cadena del cebador en una sola base. Dicha escisión permite volver a cerrar 6 nucleótidos de la horquilla, lo que se indica mediante una disminución de la longitud de la horquilla de ~4 nm. [1] Por lo tanto, la incorporación de un nucleótido complementario se indica mediante un aumento de 7 nucleótidos (+5 nm) seguido de una disminución de 6 nucleótidos (-4 nm). [1]
Después de la escisión de los últimos seis nucleótidos por la ARNasa, el siguiente paso es la fosforilación del extremo 5' por medio de la quinasa . Luego se puede repetir el siguiente ciclo de ligadura.
Muchos de los métodos competitivos de secuenciación de moléculas individuales se basan en la incorporación de nucleótidos marcados con fluorescencia. [4] [5] En la secuenciación de próxima generación, la señal de fluorescencia de los grupos se puede detectar fácilmente. Sin embargo, cuando se aplica el mismo concepto a la secuenciación de moléculas individuales, la mayor complicación resulta de las altas tasas de error. Debido a que es difícil detectar moléculas marcadas individualmente, estas plataformas sufren de bajas relaciones señal-ruido, lo que a menudo resulta en una detección errónea o no detección de señales fluorescentes. [13] En el caso de la secuenciación magnética, la señal medida son los cambios en la distancia entre dos extremos de una horquilla. Dicha señal se puede detectar fácilmente con cámaras estándar. Por lo tanto, las señales son más fáciles de detectar, incluso sin el uso de dispositivos de imágenes costosos.
Además de la naturaleza de la señal detectada, otras implementaciones en esta plataforma permiten una relación señal-ruido aún mayor. En el caso de la secuenciación magnética por hibridación, se utiliza un conjunto de mosaicos superpuestos de manera que la secuencia de cada nucleótido se determina por la hibridación de un 8-mer. [1] Por lo tanto, el instrumento solo requiere la sensibilidad para detectar un cambio de ~ 6 nm (la longitud de 8 nucleótidos). De manera similar, para la secuenciación por ciclos de ligadura, la incorporación exitosa se caracteriza por un aumento de ~ 5 nm (ligadura de un 7-mer) seguido de una disminución de ~ 4 nm (escisión de 6-mer por ARNasa) en la longitud de la horquilla. [1] En este caso, la disminución de la longitud en el segundo paso proporciona una confirmación adicional de la señal obtenida.
Con los métodos actuales, el error instrumental en la longitud de la horquilla medida es de 1-1,5 nm. [1] La longitud de un par de bases, o 2 nucleótidos monocatenarios extendidos, es de aproximadamente 0,85 nm. [1] Por lo tanto, la resolución del sistema está en unos pocos nucleótidos. Las fuentes de ruido surgen del movimiento browniano dependiente de la longitud de la perla anclada por la horquilla extendida, el error estadístico en la determinación de la posición de la perla y las derivas mecánicas lentas. [1] Sin embargo, como se mencionó anteriormente, dicha resolución es suficiente para el método de secuenciación actual porque se están midiendo cambios en >4 nm.
Mediante el uso de trampas magnéticas, [6] se puede aplicar una fuerza magnética constante a millones de perlas magnéticas unidas a horquillas de ADN en paralelo. La fuerza magnética se puede ajustar fácilmente modificando la distancia entre la trampa y las perlas magnéticas. La cantidad de perlas que se pueden monitorear simultáneamente, lo que determina el rendimiento de lectura de esta plataforma, está limitada por el tamaño de la perla, la longitud de la horquilla de ADN unida y el límite de resolución óptica. [1] Actualmente, se puede lograr una densidad de 750 K/mm2 ( comparable a un Illumina HiSeq 2000) [14] . [1]
Como se mencionó anteriormente, el ruido debido a las fluctuaciones brownianas de la perla aumenta con la longitud. Aún se deben realizar pruebas de secuenciación robustas para determinar la longitud máxima de lectura de este sistema. Sin embargo, se detectó con éxito la ligadura de un 7-mer en el medio de una horquilla de 1241 nucleótidos de longitud, lo que sugiere que el sistema actual es suficiente para secuenciar hasta ~500 pb. [1]
La velocidad de secuenciación o de obtención de imágenes depende de la velocidad de movimiento mecánico de las perlas magnéticas, que está limitada por la fuerza de arrastre. [1] Actualmente, es posible medir 10 ciclos de apertura y cierre de horquilla por segundo. [1] Otras complicaciones incluyen la existencia de una estructura de horquilla secundaria en el ADN de interés. En tal caso, el bucle de ADN que se va a ligar debe diseñarse de tal manera que su cierre se favorezca sobre el cierre del bucle endógeno en el ADN de interés. [1]