La visualización de ribosomas es una técnica utilizada para realizar la evolución de proteínas in vitro para crear proteínas que puedan unirse a un ligando deseado . El proceso da como resultado proteínas traducidas que se asocian con su progenitor de ARNm que se utiliza, como un complejo, para unirse a un ligando inmovilizado en un paso de selección. Los híbridos de ARNm-proteína que se unen bien se transcriben de forma inversa a ADNc y su secuencia se amplifica mediante PCR . [1] El resultado es una secuencia de nucleótidos que se puede utilizar para crear proteínas de unión estrecha.
La presentación de ribosomas comienza con una biblioteca nativa de secuencias de ADN que codifican polipéptidos. [2] Cada secuencia se transcribe y luego se traduce in vitro en un polipéptido. Sin embargo, la biblioteca de ADN que codifica una biblioteca particular de proteínas de unión está fusionada genéticamente con una secuencia espaciadora que carece de un codón de parada antes de su final. La falta de un codón de parada impide que los factores de liberación se unan y desencadenen el desmontaje del complejo traduccional. Entonces, esta secuencia espaciadora permanece unida al peptidil tRNA y ocupa el túnel ribosomal, y así permite que la proteína de interés sobresalga del ribosoma y se pliegue. El resultado es un complejo de ARNm, ribosoma y proteína que puede unirse al ligando unido a la superficie. Este complejo se estabiliza con la disminución de la temperatura y la adición de cationes como Mg 2+ .
Durante las etapas posteriores de unión o paneo, el complejo se introduce en un ligando unido a la superficie. Esto se puede lograr de varias maneras, por ejemplo usando una columna de cromatografía de afinidad con un lecho de resina que contiene ligando, una placa de 96 pocillos con ligando unido a la superficie inmovilizado o perlas magnéticas que han sido recubiertas con ligando. Los complejos que se unen bien quedan inmovilizados. La elución posterior de los aglutinantes mediante altas concentraciones de sal, agentes quelantes o ligandos móviles que forman complejos con el motivo de unión de la proteína permiten la disociación del ARNm. Luego, el ARNm se puede transcribir de manera inversa nuevamente a ADNc, someterse a mutagénesis e introducirse iterativamente en el proceso con una mayor presión selectiva para aislar aglutinantes aún mejores.
Al tener la proteína progenitora unida al complejo, los procesos de presentación de ribosomas omiten la separación de microarrays /perlas peptídicas/secuencia de múltiples pocillos que es común en ensayos que involucran hibridación de nucleótidos y proporciona una manera fácil de amplificar las proteínas que se unen sin descifrar el secuencia hasta que sea necesario. Al mismo tiempo, este método se basa en generar grandes grupos concentrados de diversidad de secuencias sin espacios y evitar que estas secuencias se degraden, se hibriden y reaccionen entre sí de manera que crearían espacios entre secuencias y espacios.
Tiene un historial exitoso en la ingeniería de anticuerpos [3] y proteínas terapéuticas [4] y todavía se utiliza ampliamente en estas áreas.
Los métodos competitivos para la evolución de proteínas in vitro son la presentación en fagos , la presentación en levaduras , la presentación en bacterias y la presentación en ARNm . [5] péptidos (Mattheakis, Bhatt y Dow) Como se realiza íntegramente in vitro, existen dos ventajas principales sobre otras tecnologías de selección. En primer lugar, la diversidad de la biblioteca no está limitada por la eficiencia de transformación de las células bacterianas, sino sólo por la cantidad de ribosomas y diferentes moléculas de ARNm presentes en el tubo de ensayo. En segundo lugar, las mutaciones aleatorias se pueden introducir fácilmente después de cada ronda de selección, ya que ninguna biblioteca debe transformarse después de ningún paso de diversificación. Esto permite una evolución fácil y dirigida de proteínas de unión a lo largo de varias generaciones.
Un requisito previo para la selección de proteínas de bibliotecas es el acoplamiento del genotipo (ARN, ADN) y el fenotipo (proteína). En la presentación de ribosomas, este vínculo se logra durante la traducción in vitro estabilizando el complejo formado por el ribosoma, el ARNm y el polipéptido naciente correctamente plegado. Se permite que los complejos ribosómicos se unan al objetivo inmovilizado en la superficie. Mientras que los complejos no unidos se eliminan por lavado, el ARNm de los complejos que presentan un polipéptido de unión se puede recuperar y, por tanto, la información genética de los polipéptidos de unión está disponible para su análisis.