Estructura cristalina anotada del LacI dimérico . Dos monómeros (de un total de cuatro) cooperan para unirse a cada secuencia operadora de ADN. Los monómeros (rojo y azul) contienen dominios de unión y de núcleo de ADN (marcados) que están conectados por un enlazador (marcado). No se muestra la hélice de tetramerización C-terminal. El represor se muestra en complejo con el ADN operador (oro) y ONPF (verde), un ligando antiinductor ( es decir, un estabilizador de la unión del ADN).
El represor lac (LacI) es una proteína de unión al ADN que inhibe la expresión de genes que codifican proteínas implicadas en el metabolismo de la lactosa en bacterias. Estos genes se reprimen cuando la lactosa no está disponible para la célula, lo que garantiza que la bacteria solo invierta energía en la producción de la maquinaria necesaria para la captación y utilización de la lactosa cuando esta está presente. Cuando la lactosa está disponible, primero se convierte en alolactosa por la β-galactosidasa ( lacZ ) en las bacterias. La capacidad de unión al ADN del represor lac unido a la alolactosa se inhibe debido a la regulación alostérica , por lo que se pueden expresar los genes que codifican proteínas implicadas en la captación y utilización de la lactosa.
Función
El represor lac (LacI) funciona mediante un motivo hélice-giro-hélice en su dominio de unión al ADN , uniéndose específicamente a la ranura mayor de la región operadora del operón lac , con contactos de bases también realizados por residuos de hélices alfa relacionadas con la simetría, las hélices "bisagra", que se unen profundamente en la ranura menor. [1] Este represor unido puede reducir la transcripción de las proteínas Lac ocluyendo el sitio de unión de la ARN polimerasa o incitando la formación de bucles en el ADN. [2] Cuando hay lactosa presente, la alolactosa se une al represor lac , lo que provoca un cambio alostérico en su forma. En su estado modificado, el represor lac no puede unirse firmemente a su operador cognado. Por lo tanto, el gen está mayormente desactivado en ausencia de inductor y mayormente activado en presencia de inductor, aunque el grado de expresión génica depende de la cantidad de represores en la célula y de la afinidad de unión al ADN del represor. [3] El isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) es un imitador de alolactosa de uso común que puede emplearse para inducir la transcripción de genes regulados por el represor lac .
Estructura
La LacI tetramérica se une a dos secuencias operadoras e induce la formación de bucles en el ADN. Dos subunidades funcionales diméricas de LacI (rojo+azul y verde+naranja) se unen cada una a una secuencia operadora del ADN (marcada). Estas dos subunidades funcionales están acopladas en la región de tetramerización (marcada); por lo tanto, LacI tetramérica se une a dos secuencias operadoras. Esto permite que LacI tetramérica induzca la formación de bucles en el ADN.
Estructuralmente, la proteína represora lac es un homotetrámero . Más precisamente, el tetrámero contiene dos subunidades de unión al ADN compuestas por dos monómeros cada una (un dímero de dímeros). Cada monómero consta de cuatro regiones distintas: [4] [5] [6]
Un dominio de unión al ADN N-terminal (en el que dos proteínas LacI se unen a un único sitio operador)
Un dominio regulador (a veces llamado dominio central , que se une a la alolactosa, una molécula efectora alostérica)
Un enlazador que conecta el dominio de unión del ADN con el dominio central (a veces llamado hélice de bisagra , que es importante para la comunicación alostérica [6] )
Una región de tetramerización C-terminal (que une cuatro monómeros en un haz de hélice alfa)
La unión del ADN se produce a través de un motivo estructural hélice-giro-hélice N-terminal y está dirigida a una de varias secuencias operadoras de ADN (conocidas como O 1 , O 2 y O 3 ). La secuencia operadora O 1 se superpone ligeramente con el promotor, lo que aumenta la afinidad de la ARN polimerasa por la secuencia promotora de modo que no puede entrar en elongación y permanece en iniciación abortada . Además, debido a que cada tetrámero contiene dos subunidades de unión al ADN, la unión de múltiples secuencias operadoras por un solo tetrámero induce la formación de bucles en el ADN. [7]
Cada monómero tiene 360 aminoácidos, por lo que tiene 1440 aminoácidos en total y 154.520 Dalton de masa atómica. [8]
Cinética de unión y desunión del ADN
Animación del mecanismo de unión y desunión de un dímero LacI y su sitio de ADN objetivo.
LacI encuentra su ADN operador objetivo sorprendentemente rápido. In vitro, la búsqueda es entre 10 y 100 veces más rápida que el límite superior teórico para dos partículas que se buscan entre sí mediante difusión en tres dimensiones (3D). [9] Para explicar la búsqueda rápida, se planteó la hipótesis de que LacI y otros factores de transcripción (TF) encuentran sus sitios de unión mediante difusión facilitada, una combinación de difusión libre en 3D y deslizamiento en 1D sobre el ADN. [10] Durante el deslizamiento, el represor está en contacto con la hélice de ADN, deslizándose y siguiendo su surco mayor, lo que acelera el proceso de búsqueda al extender la longitud del objetivo cuando el TF se desliza sobre el operador desde un lado. Los experimentos in vivo de una sola molécula con células de E. coli han probado y verificado el modelo de difusión facilitada y han demostrado que el TF escanea en promedio 45 pb durante cada evento de deslizamiento, antes de que el TF se desprenda espontáneamente y reanude la exploración del genoma en 3D. [11] Estos experimentos también sugieren que LacI se desliza sobre el operador O 1 varias veces antes de unirse, lo que significa que diferentes secuencias de ADN pueden tener diferentes probabilidades de ser reconocidas en cada encuentro con el TF. Esto implica un equilibrio entre la búsqueda rápida en secuencias no específicas y la unión a secuencias específicas. [11] Los experimentos in vivo e in vitro han demostrado que es esta probabilidad de reconocer el operador la que cambia con la secuencia de ADN, mientras que el tiempo que el TF permanece en la conformación unida al operador cambia menos con la secuencia. [12] El TF a menudo abandona la secuencia que se pretende regular, pero en un sitio objetivo fuerte, casi siempre hace un viaje muy corto antes de encontrar el camino de regreso nuevamente. A escala macroscópica, esto parece una interacción estable. Este mecanismo de unión explica cómo las proteínas de unión al ADN logran buscar rápidamente a través del genoma de la célula sin quedarse atascadas demasiado tiempo en secuencias que se parecen al objetivo verdadero.
Una simulación de dinámica molecular de todos los átomos sugiere que el factor de transcripción encuentra una barrera de 1 k B T durante el deslizamiento y 12 k B T para la disociación, lo que implica que el represor se deslizará sobre 8 pb en promedio antes de disociarse. [13] El modelo de búsqueda in vivo para el represor lac incluye transferencia entre segmentos y saltos, así como aglomeración por otras proteínas que hacen que el genoma en células de E. coli sea menos accesible para el represor. [14] La existencia de saltos, donde la proteína se desliza fuera del surco principal del ADN para aterrizar en otro surco cercano a lo largo de la cadena de ADN, se ha demostrado más directamente in vitro , donde se ha observado que el represor lac evita los operadores, cambia la orientación y gira con un paso más largo que el período de 10,5 pb del ADN mientras se mueve a lo largo de él. [15]
Descubrimiento
El represor lac fue aislado por primera vez por Walter Gilbert y Benno Müller-Hill en 1966. [16] Demostraron que in vitro la proteína se unía al ADN que contenía el operón lac y liberaba el ADN cuando se añadía IPTG (un análogo de la alolactosa).
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