El represor es una red reguladora genética que consta de al menos un circuito de retroalimentación con al menos tres genes, cada uno de los cuales expresa una proteína que reprime el siguiente gen en el circuito. [1] En la investigación biológica, los represores se han utilizado para construir modelos celulares y comprender la función celular. Hay represores tanto artificiales como naturales. Recientemente, se ha estudiado el circuito del gen del reloj represor natural en Arabidopsis thaliana ( A. thaliana ) y sistemas de mamíferos.
Los represiladores artificiales fueron diseñados por primera vez por Michael Elowitz y Stanislas Leibler en 2000, [2] como complemento a otros proyectos de investigación que estudian sistemas simples de componentes y funciones celulares. Para comprender y modelar el diseño y los mecanismos celulares que confieren la función a una célula, Elowitz y Leibler crearon una red artificial formada por un bucle con tres represores transcripcionales . Esta red fue diseñada desde cero para exhibir una oscilación estable que actúa como un sistema oscilador eléctrico con períodos de tiempo fijos. La red se implementó en Escherichia coli ( E. coli) mediante transferencia de ADN recombinante. Luego se verificó que las colonias diseñadas efectivamente exhibían el comportamiento oscilatorio deseado.
El represor consta de tres genes conectados en un bucle de retroalimentación , de modo que cada gen reprime al siguiente gen en el bucle y es reprimido por el gen anterior. En la inserción sintética en E. Coli se utilizó proteína fluorescente verde (GFP) como indicador para poder observar el comportamiento de la red mediante microscopía de fluorescencia .
El diseño del represilador se guió por principios biológicos y de circuito con modelos de análisis discretos y estocásticos . Se utilizaron seis ecuaciones diferenciales para modelar la cinética del sistema represilador en función de las concentraciones de proteínas y ARNm , así como los valores apropiados de los parámetros y del coeficiente de Hill . En el estudio, Elowitz y Leibler generaron figuras que muestran oscilaciones de proteínas represoras, utilizando integración y valores de parámetros típicos, así como una versión estocástica del modelo represor que utiliza parámetros similares. Estos modelos fueron analizados para determinar los valores de varias tasas que producirían una oscilación sostenida. Se descubrió que estas oscilaciones se veían favorecidas por promotores acoplados a sitios de unión a ribosomas eficientes , represores transcripcionales cooperativos y tasas de desintegración de proteínas y ARNm comparables.
Este análisis motivó dos características de diseño que se incorporaron a los genes. Primero, las regiones promotoras se reemplazaron con un promotor híbrido más eficiente que combinaba el promotor del fago lambda PL (λ PL) de E. coli con secuencias operadoras del represor lac ( Lacl ) y del represor Tet ( TetR ). En segundo lugar, para reducir la disparidad entre la vida útil de las proteínas represoras y los ARNm, se añadió una etiqueta carboxi terminal basada en la secuencia de ARN ssrA en el extremo 3' de cada gen represor. Esta etiqueta es reconocida por proteasas que se dirigen a la proteína para su degradación. El diseño se implementó utilizando un plásmido de baja copia que codifica el represor y un informador de mayor copia, que se usaron para transformar un cultivo de E. coli .
Los circuitos circadianos de las plantas presentan un circuito de retroalimentación reguladora transcripcional llamado represor. En el bucle del oscilador central (delineado en gris) de A. thaliana , la luz es detectada primero por dos criptocromos y cinco fitocromos . Dos factores de transcripción, el reloj circadiano asociado 1 (CCA1) y el hipocótilo alargado tardío (LHY), reprimen genes asociados con la expresión nocturna como el momento de la expresión CAB 1 ( TOC1 ) y activan genes asociados con la expresión matutina uniéndose a sus promotores. TOC1 , un gen vespertino, regula positivamente CCA1 y LHY mediante un mecanismo desconocido. [3] El factor de transcripción de fase nocturna CCA1 Hiking Expedition (CHE) y la histona desmetilasa jumonji C que contiene el dominio 5 (JMJD5) reprimen directamente CCA1 . Se ha descubierto que otros componentes se expresan a lo largo del día e inhiben o activan directa o indirectamente un elemento consiguiente en el circuito circadiano, creando así una red compleja, robusta y flexible de circuitos de retroalimentación. [3]
El bucle de expresión de la fase matutina se refiere a los genes y proteínas que regulan los ritmos durante el día en A. thaliana . Los dos genes principales son LHY y CCA1, que codifican los factores de transcripción LHY y CCA1. [4] Estas proteínas forman heterodímeros que ingresan al núcleo y se unen al promotor del gen TOC1 , reprimiendo la producción de la proteína TOC1. Cuando se expresa la proteína TOC1, sirve para regular LHY y CCA1 mediante la inhibición de su transcripción. Esto fue respaldado posteriormente en 2012 por la Dra. Alexandra Pokhilo, quien utilizó análisis computacionales para demostrar que TOC1 cumplía esta función como inhibidor de la expresión de LHY y CCA1 . [5] El bucle matutino sirve para inhibir el alargamiento del hipocótilo , en contraste con el bucle de la fase vespertina que promueve el alargamiento del hipocótilo. Se ha demostrado que el bucle de la fase matutina es incapaz de soportar la oscilación circadiana cuando los genes de expresión de la fase vespertina han sido mutados, [5] lo que sugiere la interdependencia de cada componente en este represor natural.
La floración temprana 3 ( ELF3 ), la floración temprana 4 ( ELF4 ) y Phytoclock1 ( LUX ) son los elementos clave en la expresión del gen del reloj de fase vespertina en A. thaliana. Forman el complejo nocturno, en el que LUX se une a los promotores del factor de interacción del fitocromo 4 ( PIF4 ) y del factor de interacción del fitocromo 5 ( PIF5 ) y los inhibe. [3] Como resultado, el alargamiento del hipocótilo se reprime temprano en la noche. Cuando la inhibición se alivia a altas horas de la noche, el hipocótilo se alarga. La floración fotoperiódica está controlada por el gen de salida Gigantea ( GI ). GI se activa por la noche y activa la expresión de Constans ( CO ), que activa la expresión del Flowering Locus T ( FT ). Luego, FT provoca la floración en días largos. [3]
Los mamíferos desarrollaron un mecanismo de sincronización endógeno para coordinar tanto la fisiología como el comportamiento en el período de 24 horas. [6] En 2016, los investigadores identificaron una secuencia de tres inhibiciones posteriores dentro de este mecanismo que identificaron como un represor, que ahora se cree que sirve como un elemento central importante de esta red circadiana. La necesidad de este sistema se estableció a través de una serie de inactivaciones genéticas entre el criptocromo ( Cry ), el período ( Per ) y Rev-erb , genes centrales del reloj de los mamíferos cuyas inactivaciones conducen a la arritmicidad. [6] El modelo que generaron estos investigadores incluye Bmal1 como controlador de la transcripción mediada por E-box, Per2 y Cry1 como represores tempranos y tardíos de E-box , respectivamente, así como el regulador de D-box Dbp y el receptor nuclear Rev- erb-α . Las inhibiciones secuenciales de Rev-erb , Per y Cry1 pueden generar oscilaciones sostenidas y, al sujetar todos los demás componentes, excepto este represilador, las oscilaciones persistieron con amplitudes y períodos similares. [6] Todas las redes oscilantes parecen involucrar cualquier combinación de estos tres genes centrales, como se demuestra en varios esquemas publicados por los investigadores.
El modelo represilador se ha utilizado para modelar y estudiar otras vías y sistemas biológicos. Desde entonces, se ha realizado un trabajo exhaustivo sobre las capacidades de modelado del represilador. En 2003, la representación y validación de los modelos biológicos del represilador, al ser un modelo con muchas variables, se realizó mediante el sistema Simpathica, que comprobó que el modelo efectivamente oscila con todas sus complejidades.
Como se afirma en el trabajo original de Elowitz y Leibler, el objetivo final de la investigación sobre represiladores es construir un reloj circadiano artificial que refleje su contraparte endógena natural. Esto implicaría desarrollar un reloj artificial con reducción de ruido y compensación de temperatura para comprender mejor los ritmos circadianos que se pueden encontrar en todos los ámbitos de la vida. [7] La alteración de los ritmos circadianos puede provocar una pérdida de ritmicidad en los procesos metabólicos y transcripcionales , e incluso acelerar la aparición de ciertas enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer . [8] En 2017, se crearon en un laboratorio osciladores que generaban ritmos circadianos y no estaban muy influenciados por la temperatura. [6]
Patológicamente , el modelo represilador se puede utilizar para modelar el crecimiento celular y las anomalías que puedan surgir, como las presentes en las células cancerosas . [9] Al hacerlo, se pueden desarrollar nuevos tratamientos basados en la actividad circadiana de las células cancerosas. Además, en 2016, un equipo de investigación mejoró el diseño anterior del represilador. Después del análisis de ruido (procesamiento de señales) , los autores trasladaron la construcción indicadora de GFP al plásmido represor y eliminaron las etiquetas de degradación de ssrA de cada proteína represora. Esto amplió el período y mejoró la regularidad de las oscilaciones del represilador. [10]
En 2019, un estudio avanzó en el modelo de Elowitz y Leibler al mejorar el sistema represilador al lograr un modelo con un estado estacionario único y una nueva función de velocidad. Este experimento amplió los conocimientos actuales sobre la represión y la regulación genética . [11]
Los represores artificiales se descubrieron implantando un bucle de inhibición sintético en E. coli . Esto representó la primera implementación de oscilaciones sintéticas en un organismo. Otras implicaciones de esto incluyen la posibilidad de rescatar sintéticamente componentes mutados de oscilaciones en organismos modelo. [7]
El represilador artificial es un hito de la biología sintética que muestra que se pueden diseñar e implementar redes reguladoras genéticas para realizar funciones novedosas. Sin embargo, se descubrió que las oscilaciones de las células se desfasaban después de un período de tiempo y que la actividad del represor artificial estaba influenciada por el crecimiento celular. Por lo tanto , el experimento inicial [7] dio una nueva apreciación del reloj circadiano que se encuentra en muchos organismos, ya que los represores endógenos son significativamente más robustos que los represores artificiales implantados. Nuevas investigaciones en el Centro de Biología Cuantitativa RIKEN han descubierto que las modificaciones químicas de una sola molécula de proteína podrían formar un oscilador autosostenible e independiente de la temperatura. [12]
Los represores artificiales podrían ayudar potencialmente a la investigación y los tratamientos en campos que van desde la biología circadiana hasta la endocrinología. Son cada vez más capaces de demostrar la sincronización inherente a los sistemas biológicos naturales y los factores que los afectan. [13]
Una mejor comprensión del represilador natural en organismos modelo con tiempos circadianos endógenos, como A. thaliana, tiene aplicaciones en la agricultura, especialmente en lo que respecta a la cría de plantas y el manejo del ganado. [14]