Una latrotoxina es una neurotoxina de alta masa molecular que se encuentra en el veneno de las arañas del género Latrodectus (arañas viudas), así como en al menos una especie de otro género de la misma familia, Steatoda nobilis . [1] Las latrotoxinas son los principales componentes activos del veneno y son responsables de los síntomas del latrodectismo .
Se han descrito las siguientes latrotoxinas: cinco toxinas insecticidas , denominadas α, β, γ, δ y ε-latroinsectotoxinas, una neurotoxina específica de vertebrados , la alfa-latrotoxina, y una toxina que afecta a los crustáceos , la α-latrocrustatoxina. [2]
La latrotoxina más estudiada es la alfa-latrotoxina, que actúa presinápticamente para liberar neurotransmisores (incluida la acetilcolina ) de las neuronas sensoriales y motoras, así como en las células endocrinas (para liberar insulina , por ejemplo). [3] Es una proteína de ~130 kDa que existe principalmente en sus formas dimerizadas o tetramerizadas.
La α-latrotoxina ( α-LTX ) se puede encontrar de forma natural en las arañas viudas del género Latrodectus . Las más conocidas de estas arañas son las viudas negras, Latrodectus mactans . [4] El veneno de las arañas viudas ( Latrodectus ) contiene varias toxinas proteicas, llamadas latrotoxinas, que se dirigen selectivamente a vertebrados , insectos o crustáceos . Una de estas toxinas es la α-latrotoxina y se dirige selectivamente contra vertebrados; es ineficaz en insectos y crustáceos. La α-LTX tiene una alta afinidad por los receptores que son específicos de las células neuronales y endocrinas de los vertebrados. [5]
A medida que se transcribe y traduce la secuencia de ADN de α-LTX, se forma una molécula precursora inactiva de α-LTX (156,9 kDa). Esta molécula precursora sufre un procesamiento postraduccional donde se forma la proteína α-LTX activa final (131,5 kDa). [6]
El extremo N de la molécula precursora de α-LTX está precedido por secuencias hidrófilas cortas que terminan en un grupo de aminoácidos básicos. Estos grupos son reconocidos por enzimas proteolíticas ( proteasas similares a la furina ), que escinden y activan las moléculas precursoras de α-LTX mediante hidrólisis. El extremo C también es reconocido por estas proteasas similares a la furina y también es escindido. [6]
Las moléculas precursoras de α-LTX son sintetizadas por ribosomas libres en el citosol y, por lo tanto, son citosólicas en las células epiteliales secretoras de las glándulas venenosas. [6] [7] Sin embargo, pueden asociarse con gránulos secretores aunque no sean absorbidas en el lumen de los gránulos. La molécula precursora citosólica de α-LTX se libera de la célula mediante secreción holocrina , donde termina en la glándula venenosa de la araña. Esta glándula contiene varias proteasas involucradas en la escisión de la molécula precursora de α-LTX. [8]
La estructura terciaria de la proteína α-LTX se puede dividir en tres partes: el ala N-terminal (36 kDa), [7] el cuerpo (76 kDa), [7] y la cabeza C-terminal (18,5 kDa). [7] Debido a las repeticiones de anquirina C-terminal, que median las interacciones proteína-proteína, el monómero α-LTX forma un dímero con otro monómero α-LTX en condiciones normales. [8] La formación de tetrámeros activa la toxicidad. [7]
La α-LTX afecta las terminaciones nerviosas motoras y las células endocrinas. No se asocia con ninguna actividad enzimática importante. [7] En cambio, la toxina puede formar poros en las membranas lipídicas e inducir el flujo de iones Ca 2+ . El inicio de los efectos por intoxicación puede ocurrir con un período de retraso de 1 a 10 minutos, incluso a niveles de concentración subnanomolar. A concentraciones nanomolares, se producen ráfagas de liberación de neurotransmisores. Después de las ráfagas, entran en vigor períodos prolongados de liberación en estado estacionario. [7] [9]
La neurotoxina induce inicialmente la estimulación de los potenciales de acción de la placa terminal pequeños , mientras que más tarde la neurotransmisión se bloquea en la unión neuromuscular. Esto se debe al agotamiento del contenido de las vesículas sinápticas. [10]
La α-LTX en su forma tetramérica interactúa con los receptores ( neurexinas y latrofilinas ) en la membrana neuronal, lo que provoca la inserción de α-LTX en la membrana.
Una vez que el tetrámero se inserta en la membrana celular, pueden ocurrir dos mecanismos de acción. Primero, la inserción puede conducir a la formación de poros y posiblemente otros efectos, y segundo, el receptor puede activarse, lo que conduce a la señalización intracelular. [8] Las cuatro cabezas del tetrámero forman un cuenco que rodea el poro, que está restringido en un punto a 10 Å. [7] Las concentraciones milimolares de Ca 2+ y Mg 2+ catalizan fuertemente la formación del tetrámero, lo que sugiere que el estado tetramétrico depende del catión divalente, mientras que el EDTA favorece la formación del dímero. La investigación también muestra que las concentraciones de La 3+ superiores a 100 μM también bloquean la tetramerización. [7] La formación de poros puede ocurrir en membranas lipídicas puras, pero los receptores reconstituidos aumentan en gran medida la formación de poros. Las membranas biológicas bloquean la formación de poros cuando no hay receptores α-LTX presentes (neurexina, latrofilina, PTPσ). [7] También se sabe que los tres residuos de cisteína altamente conservados están involucrados en la unión al receptor α-LTX, porque los mutantes que contienen serina en lugar de residuos de cisteína no indujeron toxicidad. [7] El dominio N-terminal necesita plegarse correctamente, en el que los enlaces disulfuro deben ser funcionales. La toxina α-LTX está unida por una proteína pequeña, LMWP o latrodectina. Se ha observado que la formación de poros en las bicapas lipídicas es imposible cuando la latrodectina no está disponible. La lactrodectina no tiene efecto sobre la toxicidad de α-LTX. [7]
Los poros formados por α-LTX en la membrana son permeables al Ca 2+ y, por lo tanto, permiten una entrada de Ca 2+ en la célula. Esta entrada en una célula excitable estimula la exocitosis de manera directa y eficiente. La entrada de cationes es proporcional a la cantidad de poros y, por lo tanto, a la cantidad de receptores involucrados expresados en la membrana celular. Además, el Ca 2+ facilita en gran medida la formación de los tetrámeros y, por lo tanto, la formación de poros. El poro también es permeable a los neurotransmisores, lo que provoca una fuga masiva del conjunto de neurotransmisores en el citosol . [8]
Junto con la entrada de Ca 2+ , el canal no es muy selectivo, lo que permite que Na + , K + , Ba 2+ , Sr 2+ , Mg 2+ , Li + y Cs + también pasen la membrana. El poro está abierto la mayor parte del tiempo, con una probabilidad de apertura de 0,8. La mayoría de los cationes trivalentes bloquean los canales a 50-100 μM, como Yb 3+ , Gd 3+ , Y 3+ , La 3+ y Al 3+ . [7]
El poro no solo es permeable a los cationes, sino también al agua, lo que provoca la hinchazón de las terminaciones nerviosas. Además, se producen otras alteraciones del potencial de membrana debido a la permeabilidad de las moléculas pequeñas, como los neurotransmisores y el ATP, para pasar a través del poro α-LTX.
Aunque se ha demostrado de manera concluyente la formación de poros tetraméricos de la α-latrotoxina [ cita requerida ] , algunos autores aún discuten si este es el principal modo de acción de la α-latrotoxina, y creen que la α-latrotoxina (tetramérica o no) puede penetrar a través de la membrana de las células objetivo para interactuar directamente con la maquinaria de liberación de neurotransmisores intracelulares. [ cita requerida ]
Se sugiere el siguiente mecanismo para los efectos mediados por receptores. Se han descrito tres receptores para la α-latrotoxina:
La toxina estimula un receptor, probablemente la latrofilina, que es un receptor acoplado a proteína G vinculado a Gαq/11. El efector descendente de Gαq/11 es la fosfolipasa C (PLC). Cuando se activa, la PLC aumenta la concentración citosólica de IP3, que a su vez induce la liberación de Ca 2+ de los depósitos intracelulares. Este aumento del Ca 2+ citosólico puede aumentar la probabilidad de liberación y la tasa de exocitosis espontánea. [8] La latrofilina con α-LTX puede inducir la activación de la proteína quinasa C (PKC). La PKC es responsable de la fosforilación de las proteínas SNARE. Por lo tanto, la latrofilina con α-LTX induce el efecto de la exocitosis de las vesículas de transporte. El mecanismo exacto debe descubrirse. [11]
Además de los efectos principales de la formación de poros de la α-latrotoxina, otros efectos de la α-latrotoxina están mediados por la interacción con la latrofilina y la señalización intracelular (véase transducción de señales ). [ cita requerida ]
El dímero α-LTX natural debe formar un tetrámero para ser tóxico. La tetramerización ocurre solo en presencia de cationes bivalentes (como Ca 2+ o Mg 2+ ) o moléculas anfipáticas. Los cuatro monómeros que forman este tetrámero están dispuestos simétricamente alrededor de un eje central, similar a una hélice de cuatro palas con un diámetro de 250 Å y un espesor de 100 Å. Los dominios de la cabeza forman la masa central compacta reunida y rodeada por los dominios del cuerpo. Las alas se encuentran perpendiculares al eje del tetrámero. Debido a esta forma, el tetrámero contiene un canal en forma de pera en la masa central. En el extremo inferior, el diámetro de este canal es de 25 Å, luego se ensancha a 36 Å para contraerse a 10 Å en la parte superior. [7] [8]
La base del tetrámero (debajo de las alas) tiene una profundidad de 45 Å y es hidrófoba, lo que media la inserción en la membrana celular. Además, la inserción del tetrámero solo es posible en presencia de ciertos receptores (principalmente neurexina Iα y latrofilina y PTPσ en menor medida) en la membrana. La neurexina Iα solo media la inserción en presencia de Ca 2+ , mientras que la latrofilina y PTPσ pueden mediar la inserción sin presencia de Ca 2+ . [8] Entonces, debido al canal y la inserción en la membrana celular, la proteína hace que la célula sea más permeable a las sustancias que pueden pasar a través del canal. Estas sustancias son cationes mono y bivalentes, neurotransmisores, tintes fluorescentes y ATP. [8]
La dosis letal media (DL50) de α-LTX en ratones es de 20 a 40 μg/kg de peso corporal. [8]
La DL50 del veneno de Latrodectus en mg/kg para varias especies: rana = 145, mirlo = 5,9, canario = 4,7, cucaracha = 2,7, polluelo = 2,1, ratón = 0,9, mosca doméstica = 0,6, paloma = 0,4, conejillo de indias = 0,1. [12]
La αLTX ha ayudado a confirmar la hipótesis del transporte vesicular de la liberación de transmisores, a establecer el requerimiento de Ca 2+ para la exocitosis vesicular y a caracterizar sitios individuales de liberación de transmisores en el sistema nervioso central. Ayudó a identificar dos familias de receptores importantes de la superficie celular neuronal. [8]
La forma mutante de αLTX, que se denomina αLTXN4C y no forma poros, ha contribuido a la investigación. Ha ayudado a descifrar el mecanismo de transducción de la señalización intracelular estimulada por αLTX. La toxina mutante también se puede utilizar para estudiar la naturaleza y las propiedades de los depósitos intracelulares de Ca 2+ implicados en la vía de transducción del receptor de la toxina y su efecto sobre los potenciales postsinápticos evocados. La toxina mutante también puede ser un instrumento para dilucidar las funciones endógenas de αLTX. [8]
Las presas naturales de las arañas viudas son los insectos, y en su veneno se encuentran varias insecticidas. Las insecticidas latroinsectotoxinas parecen tener estructuras similares. [13]
Las proteínas de alto peso molecular que se han aislado de la viuda negra mediterránea ( L. tredecimguttatus ) incluyen las neurotoxinas específicas de los insectos α-latroinsectotoxina y δ-latroinsectotoxina, una neurotoxina que afecta a los crustáceos conocida como latrocrustatoxina, y pequeños péptidos que inhiben la enzima convertidora de angiotensina-1 . [2]
Además de las latrotoxinas de alto peso molecular descritas anteriormente, el veneno de Latrodectus también contiene proteínas de bajo peso molecular [14] cuya función aún no se ha explorado por completo, pero que pueden estar involucradas en facilitar la inserción de latrotoxinas en la membrana. [15]