Reacción en cadena de la polimerasa

Técnica de laboratorio para multiplicar una muestra de ADN para su estudio

Una tira de ocho tubos de PCR, cada uno con 100 μL de mezcla de reacción

Colocación de una tira de ocho tubos de PCR en un ciclador térmico

La reacción en cadena de la polimerasa ( PCR ) es un método ampliamente utilizado para realizar de millones a miles de millones de copias de una muestra específica de ADN rápidamente, lo que permite a los científicos amplificar una muestra muy pequeña de ADN (o una parte de ella) lo suficiente como para permitir un estudio detallado. La PCR fue inventada en 1983 por el bioquímico estadounidense Kary Mullis en Cetus Corporation . Mullis y el bioquímico Michael Smith , que habían desarrollado otras formas esenciales de manipular el ADN, recibieron conjuntamente el Premio Nobel de Química en 1993. ^[1]

La PCR es fundamental para muchos de los procedimientos utilizados en las pruebas e investigaciones genéticas , incluido el análisis de muestras antiguas de ADN y la identificación de agentes infecciosos. Mediante la PCR, se amplifican exponencialmente copias de cantidades muy pequeñas de secuencias de ADN en una serie de ciclos de cambios de temperatura. La PCR es ahora una técnica común y a menudo indispensable que se utiliza en la investigación de laboratorio médico para una amplia variedad de aplicaciones, incluida la investigación biomédica y la ciencia forense . ^{[2] [3]}

La mayoría de los métodos de PCR se basan en ciclos térmicos . Los ciclos térmicos exponen los reactivos a ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento para permitir diferentes reacciones dependientes de la temperatura, específicamente, la fusión del ADN y la replicación del ADN impulsada por enzimas . La PCR emplea dos reactivos principales: cebadores (que son fragmentos cortos de ADN de una sola hebra conocidos como oligonucleótidos que son una secuencia complementaria a la región de ADN objetivo) y una ADN polimerasa termoestable . En el primer paso de la PCR, las dos hebras de la doble hélice de ADN se separan físicamente a una temperatura alta en un proceso llamado desnaturalización de ácidos nucleicos . En el segundo paso, se reduce la temperatura y los cebadores se unen a las secuencias complementarias de ADN. Las dos hebras de ADN luego se convierten en plantillas para que la ADN polimerasa ensamble enzimáticamente una nueva hebra de ADN a partir de nucleótidos libres , los componentes básicos del ADN. A medida que avanza la PCR, el ADN generado se utiliza como plantilla para la replicación, lo que pone en marcha una reacción en cadena en la que la plantilla de ADN original se amplifica exponencialmente .

Casi todas las aplicaciones de PCR emplean una ADN polimerasa termoestable , como la Taq polimerasa , una enzima aislada originalmente de la bacteria termófila Thermus aquaticus . Si la polimerasa utilizada fuera termoestable, se desnaturalizaría bajo las altas temperaturas del paso de desnaturalización. Antes del uso de la Taq polimerasa, la ADN polimerasa debía agregarse manualmente en cada ciclo, lo que era un proceso tedioso y costoso. ^[4]

Las aplicaciones de la técnica incluyen la clonación de ADN para secuenciación , clonación y manipulación de genes, mutagénesis genética; construcción de filogenias basadas en ADN o análisis funcional de genes ; diagnóstico y seguimiento de trastornos genéticos ; amplificación de ADN antiguo; ^[5] análisis de huellas genéticas para perfiles de ADN (por ejemplo, en ciencia forense y pruebas de paternidad ); y detección de patógenos en pruebas de ácido nucleico para el diagnóstico de enfermedades infecciosas .

Principios

Un termociclador más antiguo de tres temperaturas para PCR

La PCR amplifica una región específica de una cadena de ADN (el ADN diana). La mayoría de los métodos de PCR amplifican fragmentos de ADN de entre 0,1 y 10 kilopares de bases (kbp) de longitud, aunque algunas técnicas permiten la amplificación de fragmentos de hasta 40 kbp. ^[6] La cantidad de producto amplificado está determinada por los sustratos disponibles en la reacción, que se vuelven limitantes a medida que avanza la reacción. ^[7]

Una configuración básica de PCR requiere varios componentes y reactivos, ^[8] incluidos:

• una plantilla de ADN que contiene la región objetivo del ADN para amplificar
• una ADN polimerasa ; una enzima que polimeriza nuevas cadenas de ADN; la polimerasa Taq resistente al calor es especialmente común, ^[9] ya que es más probable que permanezca intacta durante el proceso de desnaturalización del ADN a alta temperatura
• dos cebadores de ADN que son complementarios a los extremos 3' (tres cebadores) de cada una de las cadenas sentido y antisentido del ADN diana (la ADN polimerasa solo puede unirse a una región bicatenaria de ADN y alargarse a partir de ella; sin cebadores, no hay un sitio de iniciación bicatenario al que la polimerasa pueda unirse); ^[10] los cebadores específicos que son complementarios a la región diana del ADN se seleccionan de antemano y, a menudo, se fabrican a medida en un laboratorio o se compran a proveedores bioquímicos comerciales.
• Los desoxinucleósidos trifosfatos o dNTP (a veces llamados "desoxinucleótidos trifosfatos"; nucleótidos que contienen grupos trifosfato), son los componentes básicos a partir de los cuales la ADN polimerasa sintetiza una nueva cadena de ADN.
• una solución tampón que proporciona un entorno químico adecuado para una actividad y estabilidad óptimas de la ADN polimerasa
• cationes bivalentes , típicamente iones de magnesio (Mg) o manganeso (Mn); Mg ²⁺ es el más común, pero Mn ²⁺ se puede utilizar para mutagénesis de ADN mediada por PCR , ya que una mayor concentración de Mn ²⁺ aumenta la tasa de error durante la síntesis de ADN; ^[11] y cationes monovalentes , típicamenteiones de potasio (K) ^{[ se necesita una mejor fuente ]}

La reacción se lleva a cabo comúnmente en un volumen de 10 a 200  μL en tubos de reacción pequeños (volúmenes de 0,2 a 0,5 mL) en un termociclador . El termociclador calienta y enfría los tubos de reacción para alcanzar las temperaturas requeridas en cada paso de la reacción (ver a continuación). Muchos termocicladores modernos utilizan un dispositivo Peltier , que permite tanto calentar como enfriar el bloque que contiene los tubos de PCR simplemente invirtiendo la corriente eléctrica del dispositivo. Los tubos de reacción de paredes delgadas permiten una conductividad térmica favorable para permitir un rápido equilibrio térmico. La mayoría de los termocicladores tienen tapas calefactadas para evitar la condensación en la parte superior del tubo de reacción. Los termocicladores más antiguos que carecen de una tapa calefactada requieren una capa de aceite sobre la mezcla de reacción o una bola de cera dentro del tubo. ^{[ cita requerida ]}

Procedimiento

Por lo general, la PCR consiste en una serie de 20 a 40 cambios de temperatura repetidos, llamados ciclos térmicos, y cada ciclo consta comúnmente de dos o tres pasos de temperatura discretos (ver la figura siguiente). El ciclo suele estar precedido por un solo paso de temperatura a una temperatura muy alta (>90 °C (194 °F)), y seguido por una retención al final para la extensión del producto final o un breve almacenamiento. Las temperaturas utilizadas y el tiempo que se aplican en cada ciclo dependen de una variedad de parámetros, incluida la enzima utilizada para la síntesis de ADN, la concentración de iones bivalentes y dNTP en la reacción y la temperatura de fusión ( T _m ) de los cebadores. ^[12] Los pasos individuales comunes a la mayoría de los métodos de PCR son los siguientes:

• Inicialización : este paso solo es necesario para las ADN polimerasas que requieren activación por calor mediante PCR de inicio en caliente . ^[13] Consiste en calentar la cámara de reacción a una temperatura de 94–96 °C (201–205 °F), o 98 °C (208 °F) si se utilizan polimerasas extremadamente termoestables, que luego se mantiene durante 1–10 minutos. ^{[ cita requerida ]}
• Desnaturalización : este paso es el primer evento cíclico regular y consiste en calentar la cámara de reacción a 94–98 °C (201–208 °F) durante 20–30 segundos. Esto provoca la fusión del ADN , o desnaturalización, de la plantilla de ADN bicatenario al romper los enlaces de hidrógeno entre las bases complementarias, lo que produce dos moléculas de ADN monocatenario.
• Recolección : En el siguiente paso, la temperatura de reacción se reduce a 50–65 °C (122–149 °F) durante 20–40 segundos, lo que permite la recolección de los cebadores con cada una de las plantillas de ADN monocatenario. Normalmente se incluyen dos cebadores diferentes en la mezcla de reacción: uno para cada uno de los dos complementos monocatenarios que contienen la región objetivo. Los cebadores son secuencias monocatenarias en sí mismas, pero son mucho más cortas que la longitud de la región objetivo, y complementan solo secuencias muy cortas en el extremo 3' de cada cadena. ^{[ cita requerida ]}

Es fundamental determinar una temperatura adecuada para el paso de hibridación, ya que la eficiencia y la especificidad se ven fuertemente afectadas por la temperatura de hibridación. Esta temperatura debe ser lo suficientemente baja para permitir la hibridación del cebador con la hebra, pero lo suficientemente alta para que la hibridación sea específica, es decir, el cebador debe unirse solo a una parte perfectamente complementaria de la hebra y a ninguna otra. Si la temperatura es demasiado baja, el cebador puede unirse de manera imperfecta. Si es demasiado alta, el cebador puede no unirse en absoluto. Una temperatura de hibridación típica es de aproximadamente 3 a 5 °C por debajo de la Tm de los cebadores utilizados. Los enlaces de hidrógeno estables entre bases complementarias se forman solo cuando la secuencia del cebador coincide muy de cerca con la secuencia de la plantilla _. Durante este paso, la polimerasa se une al híbrido cebador-plantilla y comienza la formación de ADN. ^{[ cita requerida ]}

• Extensión/elongación : La temperatura en este paso depende de la ADN polimerasa utilizada; la temperatura de actividad óptima para la ADN polimerasa termoestable de la Taq polimerasa es de aproximadamente 75–80 °C (167–176 °F), ^{[14] [15]} aunque una temperatura de 72 °C (162 °F) se utiliza comúnmente con esta enzima. En este paso, la ADN polimerasa sintetiza una nueva cadena de ADN complementaria a la cadena de plantilla de ADN añadiendo dNTP libres de la mezcla de reacción que es complementaria a la plantilla en la dirección 5' a 3' , condensando el grupo fosfato 5' de los dNTP con el grupo hidroxi 3' al final de la cadena de ADN naciente (elongación). El tiempo preciso necesario para la elongación depende tanto de la ADN polimerasa utilizada como de la longitud de la región diana de ADN a amplificar. Como regla general, a su temperatura óptima, la mayoría de las ADN polimerasas polimerizan mil bases por minuto. En condiciones óptimas (es decir, si no hay limitaciones debidas a sustratos o reactivos limitantes), en cada paso de extensión/elongación, se duplica el número de secuencias de ADN diana. Con cada ciclo sucesivo, las cadenas molde originales más todas las cadenas recién generadas se convierten en cadenas molde para la siguiente ronda de elongación, lo que conduce a una amplificación exponencial (geométrica) de la región de ADN diana específica. ^{[ cita requerida ]}

Los procesos de desnaturalización, hibridación y elongación constituyen un único ciclo. Se requieren múltiples ciclos para amplificar el ADN diana a millones de copias. La fórmula utilizada para calcular el número de copias de ADN formadas después de un número determinado de ciclos es 2 ⁿ , donde n es el número de ciclos. Por lo tanto, una reacción programada para 30 ciclos da como resultado 2 ³⁰ , o 1.073.741.824, copias de la región diana del ADN bicatenario original.

• Elongación final : este único paso es opcional, pero se realiza a una temperatura de 70–74 °C (158–165 °F) (el rango de temperatura requerido para la actividad óptima de la mayoría de las polimerasas utilizadas en PCR) durante 5–15 minutos después del último ciclo de PCR para garantizar que cualquier ADN monocatenario restante esté completamente elongado.
• Retención final : el paso final enfría la cámara de reacción a 4–15 °C (39–59 °F) durante un tiempo indefinido y puede emplearse para el almacenamiento a corto plazo de los productos de PCR.

Dibujo esquemático de un ciclo completo de PCR

Productos de PCR teñidos con bromuro de etidio después de la electroforesis en gel . Se utilizaron dos conjuntos de cebadores para amplificar una secuencia diana de tres muestras de tejido diferentes. No se observa amplificación en la muestra n.° 1; las bandas de ADN en las muestras n.° 2 y n.° 3 indican una amplificación exitosa de la secuencia diana. El gel también muestra un control positivo y una escalera de ADN que contiene fragmentos de ADN de longitud definida para medir el tamaño de las bandas en las PCR experimentales.

Para comprobar si la PCR generó con éxito la región de ADN objetivo prevista (también denominada a veces amplicón o amplímero ), se puede emplear la electroforesis en gel de agarosa para la separación por tamaño de los productos de PCR. El tamaño de los productos de PCR se determina mediante la comparación con una escalera de ADN , un marcador de peso molecular que contiene fragmentos de ADN de tamaños conocidos, que se ejecuta en el gel junto con los productos de PCR.

PCR de Tucker

Etapas

Amplificación exponencial

Al igual que con otras reacciones químicas, la velocidad de reacción y la eficiencia de la PCR se ven afectadas por factores limitantes. Por lo tanto, todo el proceso de PCR se puede dividir en tres etapas según el progreso de la reacción:

• Amplificación exponencial : en cada ciclo, la cantidad de producto se duplica (suponiendo una eficiencia de reacción del 100%). Después de 30 ciclos, una sola copia de ADN puede aumentarse hasta 1.000.000.000 (mil millones) de copias. En cierto sentido, entonces, la replicación de una hebra discreta de ADN se está manipulando en un tubo bajo condiciones controladas. ^[16] La reacción es muy sensible: solo deben estar presentes cantidades mínimas de ADN.
• Etapa de nivelación : la reacción se ralentiza a medida que la ADN polimerasa pierde actividad y el consumo de reactivos, como dNTP y cebadores, hace que se vuelvan más limitados.
• Meseta : No se acumula más producto por agotamiento de reactivos y enzimas.

Mejoramiento

En la práctica, la PCR puede fallar por diversas razones, como la sensibilidad o la contaminación. ^{[17] [18]} La contaminación con ADN extraño puede dar lugar a productos espurios y se aborda con protocolos y procedimientos de laboratorio que separan las mezclas previas a la PCR de los posibles contaminantes del ADN. ^[8] Por ejemplo, si se analiza el ADN de la escena de un crimen, una sola molécula de ADN del personal de laboratorio podría amplificarse y desviar la investigación. Por lo tanto, las áreas de preparación de PCR están separadas del análisis o la purificación de otros productos de PCR, se utilizan utensilios de plástico desechables y la superficie de trabajo entre las configuraciones de reacción debe limpiarse a fondo.

La especificidad se puede ajustar mediante las condiciones experimentales de modo que no se generen productos espurios. Las técnicas de diseño de cebadores son importantes para mejorar el rendimiento del producto de PCR y evitar la formación de productos inespecíficos. El uso de componentes tampón alternativos o enzimas polimerasas puede ayudar con la amplificación de regiones largas o problemáticas de ADN. Por ejemplo, se dice que la polimerasa Q5 es ~280 veces menos propensa a errores que la polimerasa Taq. ^{[19] [20]} Tanto los parámetros de ejecución (por ejemplo, la temperatura y la duración de los ciclos) como la adición de reactivos, como la formamida , pueden aumentar la especificidad y el rendimiento de la PCR. ^[21] Se pueden realizar simulaciones por computadora de los resultados teóricos de la PCR ( PCR electrónica ) para ayudar en el diseño de cebadores. ^[22]

Aplicaciones

Aislamiento selectivo de ADN

La PCR permite aislar fragmentos de ADN del ADN genómico mediante la amplificación selectiva de una región específica de ADN. Este uso de la PCR permite muchas posibilidades, como la generación de sondas de hibridación para la hibridación Southern o Northern y la clonación de ADN , que requieren mayores cantidades de ADN, que representan una región específica de ADN. La PCR proporciona a estas técnicas grandes cantidades de ADN puro, lo que permite el análisis de muestras de ADN incluso a partir de cantidades muy pequeñas de material de partida. ^{[ cita requerida ]}

Otras aplicaciones de la PCR incluyen la secuenciación de ADN para determinar secuencias desconocidas amplificadas por PCR en las que uno de los cebadores de amplificación puede usarse en la secuenciación de Sanger , el aislamiento de una secuencia de ADN para acelerar las tecnologías de ADN recombinante que implican la inserción de una secuencia de ADN en un plásmido , fago o cósmido (según el tamaño) o el material genético de otro organismo. Las colonias bacterianas (como E. coli ) pueden examinarse rápidamente mediante PCR para detectar construcciones de vectores de ADN correctas . ^[23] La PCR también puede usarse para la huella genética ; una técnica forense utilizada para identificar a una persona u organismo comparando ADN experimental a través de diferentes métodos basados ​​en PCR. ^{[ cita requerida ]}

Electroforesis de fragmentos de ADN amplificados por PCR:

1. Padre
2. Niño
3. Madre

El niño ha heredado algunas, pero no todas, las huellas dactilares de cada uno de sus padres, lo que le proporciona una huella dactilar nueva y única.

Algunos métodos de huellas dactilares de PCR tienen un alto poder discriminatorio y se pueden utilizar para identificar relaciones genéticas entre individuos, como padre-hijo o entre hermanos, y se utilizan en pruebas de paternidad (Fig. 4). Esta técnica también se puede utilizar para determinar relaciones evolutivas entre organismos cuando se utilizan ciertos relojes moleculares (es decir, los genes 16S rRNA y recA de los microorganismos). ^[24]

Amplificación y cuantificación del ADN

Debido a que la PCR amplifica las regiones de ADN a las que se dirige, la PCR se puede utilizar para analizar cantidades extremadamente pequeñas de muestra. Esto suele ser crítico para el análisis forense , cuando solo hay una cantidad traza de ADN disponible como evidencia. La PCR también se puede utilizar en el análisis de ADN antiguo que tiene decenas de miles de años. Estas técnicas basadas en PCR se han utilizado con éxito en animales, como un mamut de cuarenta mil años , y también en ADN humano, en aplicaciones que van desde el análisis de momias egipcias hasta la identificación de un zar ruso y el cuerpo del rey inglés Ricardo III . ^[25]

Los métodos de PCR cuantitativa o PCR en tiempo real (qPCR, ^[26] que no debe confundirse con RT-PCR ) permiten estimar la cantidad de una secuencia dada presente en una muestra, una técnica que se aplica a menudo para determinar cuantitativamente los niveles de expresión génica . La PCR cuantitativa es una herramienta establecida para la cuantificación del ADN que mide la acumulación de producto de ADN después de cada ronda de amplificación por PCR.

La qPCR permite cuantificar y detectar una secuencia específica de ADN en tiempo real, ya que mide la concentración mientras se lleva a cabo el proceso de síntesis. Existen dos métodos para la detección y cuantificación simultáneas. El primer método consiste en utilizar colorantes fluorescentes que se retienen de forma inespecífica entre las dobles hebras. El segundo método implica sondas que codifican secuencias específicas y están marcadas con fluorescencia. La detección de ADN mediante estos métodos solo se puede ver después de que se produzca la hibridación de las sondas con su ADN complementario (ADNc). Una combinación de técnicas interesante es la PCR en tiempo real y la transcripción inversa. Esta sofisticada técnica, llamada RT-qPCR, permite cuantificar una pequeña cantidad de ARN. A través de esta técnica combinada, el ARNm se convierte en ADNc, que se cuantifica aún más mediante qPCR. Esta técnica reduce la posibilidad de error en el punto final de la PCR, ^[27] aumentando las posibilidades de detección de genes asociados a enfermedades genéticas como el cáncer. ^[5] Los laboratorios utilizan la RT-qPCR con el fin de medir de forma sensible la regulación genética. Los fundamentos matemáticos para la cuantificación confiable de la PCR ^[28] y RT-qPCR ^[29] facilitan la implementación de procedimientos de ajuste precisos de datos experimentales en aplicaciones de investigación, médicas, de diagnóstico y de enfermedades infecciosas. ^{[30] [31] [32] [33]}

Aplicaciones médicas y de diagnóstico

Los futuros padres pueden ser sometidos a pruebas para detectar si son portadores genéticos , o sus hijos pueden ser sometidos a pruebas para detectar si realmente padecen una enfermedad . ^[2] Las muestras de ADN para pruebas prenatales se pueden obtener mediante amniocentesis , muestreo de vellosidades coriónicas o incluso mediante el análisis de células fetales raras que circulan en el torrente sanguíneo de la madre. El análisis de PCR también es esencial para el diagnóstico genético preimplantacional , donde se analizan las células individuales de un embrión en desarrollo para detectar mutaciones.

• La PCR también puede utilizarse como parte de una prueba sensible para la tipificación de tejidos , algo vital para el trasplante de órganos . A partir de 2008, ^[actualizar]existe incluso una propuesta para reemplazar las pruebas tradicionales basadas en anticuerpos para determinar el tipo de sangre por pruebas basadas en PCR. ^[34]
• Muchas formas de cáncer implican alteraciones en los oncogenes . Mediante el uso de pruebas basadas en PCR para estudiar estas mutaciones, los regímenes de terapia a veces se pueden personalizar individualmente para un paciente. La PCR permite el diagnóstico temprano de enfermedades malignas como la leucemia y los linfomas , que actualmente es la técnica más desarrollada en la investigación del cáncer y ya se está utilizando de forma rutinaria. Los ensayos de PCR se pueden realizar directamente en muestras de ADN genómico para detectar células malignas específicas de la translocación con una sensibilidad que es al menos 10.000 veces mayor que la de otros métodos. ^[35] La PCR es muy útil en el campo médico ya que permite el aislamiento y la amplificación de supresores tumorales. La PCR cuantitativa, por ejemplo, se puede utilizar para cuantificar y analizar células individuales, así como para reconocer confirmaciones y combinaciones de ADN, ARNm y proteínas. ^[27]

Aplicaciones en enfermedades infecciosas

La PCR permite un diagnóstico rápido y altamente específico de enfermedades infecciosas, incluidas aquellas causadas por bacterias o virus. ^[36] La PCR también permite la identificación de microorganismos no cultivables o de crecimiento lento como micobacterias , bacterias anaeróbicas o virus a partir de ensayos de cultivo de tejidos y modelos animales . La base de las aplicaciones de diagnóstico por PCR en microbiología es la detección de agentes infecciosos y la discriminación de cepas no patógenas de patógenas en virtud de genes específicos. ^{[36] [37]}

La caracterización y detección de organismos que provocan enfermedades infecciosas se ha revolucionado mediante PCR de las siguientes maneras:

• El virus de inmunodeficiencia humana (o VIH ) es un objetivo difícil de encontrar y erradicar. Las primeras pruebas de infección se basaban en la presencia de anticuerpos contra el virus circulando en el torrente sanguíneo. Sin embargo, los anticuerpos no aparecen hasta muchas semanas después de la infección, los anticuerpos maternos enmascaran la infección de un recién nacido y los agentes terapéuticos para combatir la infección no afectan a los anticuerpos. Se han desarrollado pruebas de PCR que pueden detectar tan solo un genoma viral entre el ADN de más de 50.000 células huésped. ^[38] Las infecciones se pueden detectar antes, la sangre donada se puede analizar directamente para detectar el virus, los recién nacidos se pueden analizar inmediatamente para detectar la infección y los efectos de los tratamientos antivirales se pueden cuantificar .
• Algunos organismos patógenos, como el de la tuberculosis , son difíciles de obtener de los pacientes y su cultivo en el laboratorio es lento . Las pruebas basadas en PCR han permitido detectar pequeñas cantidades de organismos patógenos (vivos o muertos) en muestras convenientes . El análisis genético detallado también se puede utilizar para detectar la resistencia a los antibióticos, lo que permite una terapia inmediata y eficaz. Los efectos de la terapia también se pueden evaluar de inmediato.
• La propagación de un organismo patógeno a través de poblaciones de animales domésticos o salvajes se puede controlar mediante pruebas de PCR. En muchos casos, se puede detectar y controlar la aparición de nuevos subtipos virulentos. Los subtipos de un organismo que fueron responsables de epidemias anteriores también se pueden determinar mediante análisis de PCR.
• El ADN viral se puede detectar mediante PCR. Los iniciadores utilizados deben ser específicos para las secuencias diana en el ADN de un virus, y la PCR se puede utilizar para análisis de diagnóstico o secuenciación de ADN del genoma viral. La alta sensibilidad de la PCR permite la detección del virus poco después de la infección e incluso antes de la aparición de la enfermedad. ^[36] Esta detección temprana puede dar a los médicos un tiempo de anticipación significativo en el tratamiento. La cantidad de virus (" carga viral ") en un paciente también se puede cuantificar mediante técnicas de cuantificación de ADN basadas en PCR (ver más abajo). Se utiliza una variante de la PCR ( RT-PCR ) para detectar ARN viral en lugar de ADN: en esta prueba se utiliza la enzima transcriptasa inversa para generar una secuencia de ADN que coincida con el ARN viral; este ADN se amplifica luego según el método de PCR habitual. La RT-PCR se utiliza ampliamente para detectar el genoma viral del SARS-CoV-2. ^[39]
• Enfermedades como la tos ferina (o tos convulsa ) son causadas por la bacteria Bordetella pertussis . Esta bacteria se caracteriza por una infección respiratoria aguda grave que afecta a varios animales y humanos y ha provocado la muerte de muchos niños pequeños. La toxina de la tos ferina es una exotoxina proteica que se une a los receptores celulares mediante dos dímeros y reacciona con diferentes tipos de células, como los linfocitos T, que desempeñan un papel en la inmunidad celular. ^[40] La PCR es una herramienta de prueba importante que puede detectar secuencias dentro del gen de la toxina de la tos ferina. Debido a que la PCR tiene una alta sensibilidad para la toxina y un tiempo de respuesta rápido, es muy eficiente para diagnosticar la tos ferina en comparación con el cultivo. ^[41]

Aplicaciones forenses

El desarrollo de protocolos de huellas genéticas (o de ADN ) basados ​​en PCR ha tenido una amplia aplicación en la ciencia forense :

• 

  Con frecuencia se toman muestras de ADN en las escenas del crimen y se analizan mediante PCR.

  En su forma más discriminatoria, la huella genética puede discriminar de forma única a cualquier persona de toda la población del mundo . Se pueden aislar muestras diminutas de ADN de la escena de un crimen y compararlas con las de los sospechosos o con las de una base de datos de ADN de pruebas o convictos anteriores. Las versiones más simples de estas pruebas se utilizan a menudo para descartar rápidamente a los sospechosos durante una investigación criminal. Se pueden analizar las pruebas de delitos cometidos hace décadas, lo que confirma o exonera a las personas condenadas originalmente.
• La tipificación forense del ADN ha sido una forma eficaz de identificar o exonerar a sospechosos de delitos debido al análisis de pruebas descubiertas en la escena de un crimen. El genoma humano tiene muchas regiones repetitivas que se pueden encontrar dentro de secuencias genéticas o en regiones no codificantes del genoma. Específicamente, hasta el 40% del ADN humano es repetitivo. ^[5] Hay dos categorías distintas para estas regiones repetitivas y no codificantes en el genoma. La primera categoría se llama repeticiones en tándem de número variable (VNTR), que tienen una longitud de 10 a 100 pares de bases y la segunda categoría se llama repeticiones en tándem cortas (STR) y consisten en secciones repetidas de 2 a 10 pares de bases. La PCR se utiliza para amplificar varias VNTR y STR conocidas utilizando cebadores que flanquean cada una de las regiones repetitivas. Los tamaños de los fragmentos obtenidos de cualquier individuo para cada uno de los STR indicarán qué alelos están presentes. Al analizar varios STR de un individuo, se encontrará un conjunto de alelos para cada persona que, estadísticamente, es probable que sea único. ^[5] Los investigadores han identificado la secuencia completa del genoma humano. Se puede acceder fácilmente a esta secuencia a través del sitio web del NCBI y se utiliza en muchas aplicaciones de la vida real. Por ejemplo, el FBI ha compilado un conjunto de sitios de marcadores de ADN utilizados para la identificación, y estos se denominan base de datos de ADN del Sistema de índice de ADN combinado (CODIS). ^[5] El uso de esta base de datos permite utilizar el análisis estadístico para determinar la probabilidad de que una muestra de ADN coincida. La PCR es una herramienta analítica muy poderosa y significativa para usar en la tipificación de ADN forense porque los investigadores solo necesitan una cantidad muy pequeña del ADN objetivo para usarla en el análisis. Por ejemplo, un solo cabello humano con folículo piloso adherido tiene suficiente ADN para realizar el análisis. De manera similar, unos pocos espermatozoides, muestras de piel de debajo de las uñas o una pequeña cantidad de sangre pueden proporcionar suficiente ADN para un análisis concluyente. ^[5]
• Las formas menos discriminatorias de identificación de ADN pueden ayudar en las pruebas de paternidad de ADN , donde se empareja a un individuo con sus parientes cercanos. El ADN de restos humanos no identificados se puede analizar y comparar con el de posibles padres, hermanos o hijos. Se pueden utilizar pruebas similares para confirmar los padres biológicos de un niño adoptado (o secuestrado). También se puede confirmar (o descartar) al padre biológico real de un recién nacido.
• Se ha demostrado que el diseño PCR AMGX/AMGY no solo facilita ^{[ aclaración necesaria ]} la amplificación de secuencias de ADN de una cantidad muy minúscula de genoma, sino que también se puede utilizar para la determinación del sexo en tiempo real a partir de muestras óseas forenses. Esto proporciona una forma poderosa y eficaz de determinar el sexo en casos forenses y especímenes antiguos. ^[42]

Aplicaciones de investigación

La PCR se ha aplicado a muchas áreas de investigación en genética molecular:

• La PCR permite la producción rápida de fragmentos cortos de ADN, incluso cuando no se conoce más que la secuencia de los dos cebadores. Esta capacidad de la PCR amplía muchos métodos, como la generación de sondas de hibridación para hibridación Southern o Northern blot . La PCR proporciona a estas técnicas grandes cantidades de ADN puro, a veces como una sola hebra, lo que permite el análisis incluso a partir de cantidades muy pequeñas de material de partida.
• La PCR también puede ayudar a la secuenciación del ADN . Se pueden generar fácilmente segmentos conocidos de ADN de un paciente con una mutación de una enfermedad genética. Modificando la técnica de amplificación se pueden extraer segmentos de un genoma completamente desconocido o se puede generar una sola hebra de un área de interés.
• La PCR tiene numerosas aplicaciones en el proceso más tradicional de clonación de ADN . Puede extraer segmentos para su inserción en un vector a partir de un genoma más grande, que puede estar disponible solo en pequeñas cantidades. Utilizando un único conjunto de "cebadores de vector", también puede analizar o extraer fragmentos que ya se han insertado en vectores. Algunas alteraciones del protocolo de PCR pueden generar mutaciones (generales o dirigidas al sitio) de un fragmento insertado.
• Los sitios marcados con secuencias son un proceso en el que se utiliza la PCR como indicador de que un segmento particular de un genoma está presente en un clon en particular. El Proyecto Genoma Humano consideró que esta aplicación era vital para mapear los clones cósmidos que estaban secuenciando y para coordinar los resultados de diferentes laboratorios.
• Una aplicación de la PCR es el análisis filogenético del ADN de fuentes antiguas , como el encontrado en los huesos recuperados de los neandertales , de los tejidos congelados de los mamuts o del cerebro de las momias egipcias. ^[16] En algunos casos, el ADN altamente degradado de estas fuentes podría reensamblarse durante las primeras etapas de la amplificación.
• Una aplicación común de la PCR es el estudio de patrones de expresión génica . Se pueden analizar tejidos (o incluso células individuales) en diferentes etapas para ver qué genes se han activado o se han desactivado. Esta aplicación también puede utilizar la PCR cuantitativa para cuantificar los niveles reales de expresión.
• La capacidad de la PCR para amplificar simultáneamente varios loci de espermatozoides individuales ^[43] ha mejorado enormemente la tarea más tradicional de mapeo genético mediante el estudio de entrecruzamientos cromosómicos después de la meiosis . Se han observado directamente eventos raros de entrecruzamiento entre loci muy cercanos mediante el análisis de miles de espermatozoides individuales. De manera similar, se pueden analizar deleciones, inserciones, translocaciones o inversiones inusuales, todo ello sin tener que esperar (o pagar) por los largos y laboriosos procesos de fertilización, embriogénesis, etc.
• Mutagénesis dirigida : la PCR se puede utilizar para crear genes mutantes con mutaciones elegidas por los científicos a voluntad. Estas mutaciones se pueden elegir para comprender cómo las proteínas cumplen sus funciones y para cambiar o mejorar su funcionamiento.

Ventajas

La PCR tiene varias ventajas. Es bastante sencilla de entender y utilizar, y produce resultados rápidamente. La técnica es muy sensible y tiene el potencial de producir millones o miles de millones de copias de un producto específico para secuenciación, clonación y análisis. La qRT-PCR comparte las mismas ventajas que la PCR, con la ventaja añadida de la cuantificación del producto sintetizado. Por lo tanto, tiene sus usos para analizar alteraciones de los niveles de expresión génica en tumores, microbios u otros estados patológicos. ^[27]

La PCR es una herramienta de investigación muy potente y práctica. Gracias a ella se está descifrando la secuenciación de etiologías desconocidas de muchas enfermedades. Esta técnica puede ayudar a identificar la secuencia de virus previamente desconocidos relacionados con los ya conocidos y, de este modo, nos permite comprender mejor la enfermedad en sí. Si se puede simplificar aún más el procedimiento y desarrollar sistemas de detección sensibles no radiométricos, la PCR ocupará un lugar destacado en el laboratorio clínico durante los próximos años. ^[16]

Limitaciones

Una limitación importante de la PCR es que se necesita información previa sobre la secuencia objetivo para generar los cebadores que permitirán su amplificación selectiva. ^[27] Esto significa que, normalmente, los usuarios de PCR deben conocer la(s) secuencia(s) precisa(s) aguas arriba de la región objetivo en cada una de las dos plantillas monocatenarias para garantizar que la ADN polimerasa se una correctamente a los híbridos cebador-plantilla y posteriormente genere toda la región objetivo durante la síntesis de ADN. ^{[ cita requerida ]}

Como todas las enzimas, las ADN polimerasas también son propensas a errores, lo que a su vez provoca mutaciones en los fragmentos de PCR que se generan. ^[44]

Otra limitación de la PCR es que incluso la cantidad más pequeña de ADN contaminante puede ser amplificada, lo que da como resultado resultados engañosos o ambiguos. Para minimizar la posibilidad de contaminación, los investigadores deben reservar salas separadas para la preparación de reactivos, la PCR y el análisis del producto. Los reactivos deben dispensarse en alícuotas de un solo uso . Se deben utilizar de forma rutinaria pipetas con émbolos desechables y puntas de pipeta extralargas. ^[16] Además, se recomienda garantizar que la configuración del laboratorio siga un flujo de trabajo unidireccional. Ningún material o reactivo utilizado en las salas de PCR y análisis debe llevarse nunca a la sala de preparación de PCR sin una descontaminación completa. ^[45]

Las muestras ambientales que contienen ácidos húmicos pueden inhibir la amplificación por PCR y dar lugar a resultados inexactos. ^{[ cita requerida ]}

Variaciones

• PCR específica de alelo o sistema de mutación refractaria a la amplificación (ARMS) : una técnica de diagnóstico o clonación basada en variaciones de un solo nucleótido (SNV, que no deben confundirse con SNP ) (diferencias de una sola base en un paciente). Cualquier mutación que implique un cambio de una sola base puede detectarse mediante este sistema. Requiere conocimiento previo de una secuencia de ADN, incluidas las diferencias entre alelos , y utiliza cebadores cuyos extremos 3' abarcan el SNV (generalmente se incorpora un tampón de pares de bases alrededor del SNV). ^[46] La amplificación por PCR en condiciones estrictas es mucho menos eficiente en presencia de un desajuste entre la plantilla y el cebador, por lo que la amplificación exitosa con un cebador específico de SNP señala la presencia del SNP específico o pequeñas deleciones en una secuencia. ^[47] Consulte genotipificación de SNP para obtener más información.
• PCR de ensamblaje o ensamblaje cíclico de la polimerasa (PCA) : síntesis artificial de secuencias largas de ADN mediante la realización de PCR en un conjunto de oligonucleótidos largos con segmentos superpuestos cortos. Los oligonucleótidos alternan entre direcciones sentido y antisentido, y los segmentos superpuestos determinan el orden de los fragmentos de PCR, produciendo así selectivamente el producto final de ADN largo. ^[48]
• PCR asimétrica : amplifica preferentemente una cadena de ADN en una plantilla de ADN bicatenario. Se utiliza en la secuenciación y el sondeo de hibridación donde se requiere la amplificación de solo una de las dos cadenas complementarias. La PCR se lleva a cabo como de costumbre, pero con un gran exceso del cebador para la cadena objetivo para la amplificación. Debido a la amplificación lenta ( aritmética ) más tarde en la reacción después de que se haya agotado el cebador limitante, se requieren ciclos adicionales de PCR.[ 49 ] ^Una modificación reciente de este proceso, conocida como PCR lineal después deexponencial ( LATE-PCR), utiliza un cebador limitante con una temperatura de fusión ( Tm ) más alta que el cebador en exceso para mantener la eficiencia de la reacción a medida que la concentración del cebador limitante disminuye a mitad de la reacción. ^[50]
• PCR convectiva : una forma pseudoisotérmica de realizar PCR. En lugar de calentar y enfriar repetidamente la mezcla de PCR, la solución se somete a un gradiente térmico. El flujo convectivo resultante impulsado por la inestabilidad térmica baraja automáticamente los reactivos de PCR de las regiones frías y calientes repetidamente, lo que permite la PCR. ^[51] Los parámetros como las condiciones de los límites térmicos y la geometría del recinto de PCR se pueden optimizar para producir una PCR robusta y rápida aprovechando la aparición de campos de flujo caóticos. ^[52] Esta configuración de PCR de flujo convectivo reduce significativamente los requisitos de energía del dispositivo y el tiempo de funcionamiento.
• PCR de marcado directo : un método altamente paralelo para recuperar moléculas de ADN precisas para la síntesis de genes. Se modifica una biblioteca compleja de moléculas de ADN con marcadores flanqueantes únicos antes de la secuenciación masiva en paralelo. Los cebadores dirigidos por marcadores permiten luego la recuperación de moléculas con secuencias deseadas mediante PCR. ^[53]
• PCR digital (dPCR) : se utiliza para medir la cantidad de una secuencia de ADN diana en una muestra de ADN. La muestra de ADN está muy diluida, de modo que después de realizar muchas PCR en paralelo, algunas de ellas no reciben ni una sola molécula del ADN diana. La concentración de ADN diana se calcula utilizando la proporción de resultados negativos. De ahí el nombre de "PCR digital".
• Amplificación dependiente de helicasa : similar a la PCR tradicional, pero utiliza una temperatura constante en lugar de pasar por ciclos de desnaturalización y de hibridación/extensión. La helicasa de ADN , una enzima que desenrolla el ADN, se utiliza en lugar de la desnaturalización térmica. ^[54]
• PCR de inicio en caliente : una técnica que reduce la amplificación no específica durante las etapas iniciales de configuración de la PCR. Puede realizarse manualmente calentando los componentes de la reacción a la temperatura de desnaturalización (por ejemplo, 95 °C) antes de agregar la polimerasa. ^[55] Se han desarrollado sistemas enzimáticos especializados que inhiben la actividad de la polimerasa a temperatura ambiente, ya sea mediante la unión de un anticuerpo ^{[13] [56]} o por la presencia de inhibidores unidos covalentemente que se disocian solo después de un paso de activación a alta temperatura. La PCR de inicio en caliente/finalización en frío se logra con nuevas polimerasas híbridas que son inactivas a temperatura ambiente y se activan instantáneamente a la temperatura de elongación.
• La PCR in silico (PCR digital, PCR virtual, PCR electrónica, e-PCR) se refiere a las herramientas computacionales utilizadas para calcular los resultados teóricos de la reacción en cadena de la polimerasa utilizando un conjunto dado de cebadores ( sondas ) para amplificar secuencias de ADN de un genoma o transcriptoma secuenciado . La PCR in silico se propuso como una herramienta educativa para la biología molecular. ^[57]
• PCR entre secuencias específicas (ISSR): un método de PCR para la identificación de huellas dactilares de ADN que amplifica regiones entre repeticiones de secuencias simples para producir una huella dactilar única de longitudes de fragmentos amplificados. ^[58]
• PCR inversa : se utiliza comúnmente para identificar las secuencias flanqueantes alrededor de los insertos genómicos . Implica una serie de digestiones de ADN y autoligación , lo que da como resultado secuencias conocidas en cada extremo de la secuencia desconocida. ^[59]
• PCR mediada por ligadura : utiliza pequeños enlaces de ADN ligados al ADN de interés y múltiples cebadores que se unen a los enlaces de ADN; se ha utilizado para la secuenciación de ADN , el recorrido genómico y la huella de ADN . ^[60]
• PCR específica de metilación (MSP): desarrollada por Stephen Baylin y James G. Herman en la Facultad de Medicina de Johns Hopkins, ^[61] y se utiliza para detectar la metilación de las islas CpG en el ADN genómico. El ADN se trata primero con bisulfito de sodio, que convierte las bases de citosina no metiladas en uracilo, que es reconocido por los cebadores de PCR como timina. A continuación, se llevan a cabo dos PCR en el ADN modificado, utilizando conjuntos de cebadores idénticos excepto en cualquier isla CpG dentro de las secuencias de cebadores. En estos puntos, un conjunto de cebadores reconoce el ADN con citosinas para amplificar el ADN metilado, y un conjunto reconoce el ADN con uracilo o timina para amplificar el ADN no metilado. La MSP mediante qPCR también se puede realizar para obtener información cuantitativa en lugar de cualitativa sobre la metilación.
• PCR con minicebadores : utiliza una polimerasa termoestable (S-Tbr) que puede extenderse a partir de cebadores cortos ("smalligos") de hasta 9 o 10 nucleótidos. Este método permite la PCR dirigida a regiones de unión de cebadores más pequeñas y se utiliza para amplificar secuencias de ADN conservadas, como el gen del ARNr 16S (o 18S eucariota). ^[62]
• Amplificación de sonda dependiente de ligación multiplex ( MLPA ): permite amplificar múltiples objetivos con un solo par de cebadores, evitando así las limitaciones de resolución de la PCR multiplex (ver más abajo).
• PCR multiplex : consiste en múltiples conjuntos de cebadores dentro de una única mezcla de PCR para producir amplicones de distintos tamaños que son específicos de diferentes secuencias de ADN. Al apuntar a múltiples genes a la vez, se puede obtener información adicional de una única prueba que, de otro modo, requeriría varias veces más reactivos y más tiempo para realizarla. Las temperaturas de hibridación para cada uno de los conjuntos de cebadores deben optimizarse para que funcionen correctamente dentro de una única reacción y tamaños de amplicón. Es decir, la longitud de sus pares de bases debe ser lo suficientemente diferente como para formar bandas distintas cuando se visualicen mediante electroforesis en gel .
• PCR asistida por nanopartículas (nanoPCR) : algunas nanopartículas (NP) pueden mejorar la eficiencia de la PCR (por lo que se las llama nanoPCR), y algunas incluso pueden superar a los potenciadores de PCR originales. Se informó que los puntos cuánticos (QD) pueden mejorar la especificidad y la eficiencia de la PCR. Los nanotubos de carbono de pared simple (SWCNT) y los nanotubos de carbono de pared múltiple (MWCNT) son eficientes para mejorar la amplificación de la PCR larga. El nanopolvo de carbono (CNP) puede mejorar la eficiencia de la PCR repetida y la PCR larga, mientras que se descubrió que el óxido de zinc , el dióxido de titanio y las NP de Ag aumentan el rendimiento de la PCR. Los datos anteriores indicaron que las NP no metálicas mantuvieron una fidelidad de amplificación aceptable. Dado que muchas NP son capaces de mejorar la eficiencia de la PCR, está claro que es probable que exista un gran potencial para las mejoras de la tecnología nanoPCR y el desarrollo de productos. ^{[63] [64]}
• PCR anidada : aumenta la especificidad de la amplificación de ADN, al reducir el ruido de fondo debido a la amplificación no específica del ADN. Se utilizan dos conjuntos de cebadores en dos PCR sucesivas. En la primera reacción, se utiliza un par de cebadores para generar productos de ADN, que además del objetivo previsto, pueden consistir en fragmentos de ADN amplificados de forma no específica. A continuación, el producto o los productos se utilizan en una segunda PCR con un conjunto de cebadores cuyos sitios de unión son total o parcialmente diferentes y se encuentran a 3' de cada uno de los cebadores utilizados en la primera reacción. La PCR anidada suele ser más eficaz para amplificar específicamente fragmentos largos de ADN que la PCR convencional, pero requiere un conocimiento más detallado de las secuencias objetivo.
• PCR de extensión por superposición o Splicing por extensión por superposición (SOEing) : técnica de ingeniería genética que se utiliza para unir dos o más fragmentos de ADN que contienen secuencias complementarias. Se utiliza para unir fragmentos de ADN que contienen genes, secuencias reguladoras o mutaciones; la técnica permite la creación de construcciones de ADN específicas y largas. También puede introducir deleciones, inserciones o mutaciones puntuales en una secuencia de ADN. ^{[65] [66]}
• PAN-AC : utiliza condiciones isotérmicas para la amplificación y puede utilizarse en células vivas. ^{[67] [68]}
• PAN-PCR : un método computacional para diseñar ensayos de tipificación de bacterias basados ​​en datos de secuencia del genoma completo. ^[69]
• PCR cuantitativa (qPCR): se utiliza para medir la cantidad de una secuencia diana (comúnmente en tiempo real). Mide cuantitativamente las cantidades iniciales de ADN, ADNc o ARN. La PCR cuantitativa se utiliza comúnmente para determinar si una secuencia de ADN está presente en una muestra y el número de sus copias en la muestra. La PCR cuantitativa tiene un grado muy alto de precisión. Los métodos de PCR cuantitativa utilizan colorantes fluorescentes, como Sybr Green, EvaGreen o sondas de ADN que contienen fluoróforos , como TaqMan , para medir la cantidad de producto amplificado en tiempo real. A veces también se abrevia como RT-PCR ( PCR en tiempo real ), pero esta abreviatura debe usarse solo para PCR de transcripción inversa . qPCR es la contracción apropiada para PCR cuantitativa (PCR en tiempo real).
• PCR de complemento inverso (RC-PCR): permite la adición de dominios funcionales o secuencias de elección para que se añadan de forma independiente a cualquiera de los extremos del amplicón generado en una única reacción en tubo cerrado. Este método genera cebadores específicos del objetivo dentro de la reacción mediante la interacción de cebadores universales (que contienen las secuencias o dominios deseados que se añadirán) y sondas RC.
• PCR con transcripción inversa ( RT-PCR ) : para amplificar ADN a partir de ARN. La transcriptasa inversa transcribe de forma inversa el ARN en ADNc , que luego se amplifica mediante PCR. La RT-PCR se utiliza ampliamente en la elaboración de perfiles de expresión , para determinar la expresión de un gen o para identificar la secuencia de una transcripción de ARN, incluidos los sitios de inicio y terminación de la transcripción. Si se conoce la secuencia de ADN genómico de un gen, se puede utilizar la RT-PCR para mapear la ubicación de los exones e intrones en el gen. El extremo 5' de un gen (que corresponde al sitio de inicio de la transcripción) se identifica típicamente mediante RACE-PCR ( amplificación rápida de extremos de ADNc ).
• PCR dependiente de ARNasa H (rhPCR): una modificación de la PCR que utiliza cebadores con un bloque de extensión 3' que puede eliminarse mediante una enzima ARNasa HII termoestable. Este sistema reduce los dímeros de cebadores y permite realizar reacciones multiplexadas con una mayor cantidad de cebadores. ^[70]
• PCR con cebador específico único (SSP-PCR): permite la amplificación de ADN bicatenario incluso cuando la información de la secuencia está disponible solo en un extremo. Este método permite la amplificación de genes para los que solo se dispone de información parcial de la secuencia y permite el desplazamiento unidireccional del genoma desde regiones conocidas a regiones desconocidas del cromosoma. ^[71]
• PCR en fase sólida : abarca múltiples significados, incluida la amplificación de polonía (donde las colonias de PCR se derivan en una matriz de gel, por ejemplo), PCR puente ^[72] (los cebadores están unidos covalentemente a una superficie de soporte sólido), PCR en fase sólida convencional (donde la PCR asimétrica se aplica en presencia de un cebador que lleva un soporte sólido con una secuencia que coincide con uno de los cebadores acuosos) y PCR en fase sólida mejorada ^[73] (donde la PCR en fase sólida convencional se puede mejorar empleando una Tm alta y un cebador de soporte sólido anidado con la aplicación opcional de un "paso" térmico para favorecer el cebado del soporte sólido).
• PCR suicida : se utiliza normalmente en paleogenética u otros estudios en los que evitar los falsos positivos y garantizar la especificidad del fragmento amplificado es la máxima prioridad. Se describió originalmente en un estudio para verificar la presencia del microbio Yersinia pestis en muestras dentales obtenidas de tumbas del siglo XIV de personas supuestamente asesinadas por la peste durante la epidemia medieval de la Muerte Negra . ^[74] El método prescribe el uso de cualquier combinación de cebadores solo una vez en una PCR (de ahí el término "suicidio"), que nunca debería haberse utilizado en ninguna reacción de PCR de control positivo, y los cebadores siempre deben apuntar a una región genómica nunca amplificada antes en el laboratorio utilizando este o cualquier otro conjunto de cebadores. Esto garantiza que no haya ADN contaminante de reacciones de PCR anteriores en el laboratorio, que de lo contrario podría generar falsos positivos.
• PCR asimétrica entrelazada térmica (TAIL-PCR) : para aislar una secuencia desconocida que flanquea una secuencia conocida. Dentro de la secuencia conocida, la TAIL-PCR utiliza un par anidado de cebadores con diferentes temperaturas de hibridación; se utiliza un cebador degenerado para amplificar en la otra dirección desde la secuencia desconocida. ^[75]
• PCR de bajada ( PCR de bajada ): una variante de PCR que tiene como objetivo reducir el fondo inespecífico al disminuir gradualmente la temperatura de hibridación a medida que avanza el ciclo de PCR. La temperatura de hibridación en los ciclos iniciales suele ser unos pocos grados (3–5 °C) superior a la Tm _de los cebadores utilizados, mientras que en los ciclos posteriores, es unos pocos grados (3–5 °C) inferior a la Tm del cebador _. Las temperaturas más altas dan mayor especificidad para la unión del cebador, y las temperaturas más bajas permiten una amplificación más eficiente a partir de los productos específicos formados durante los ciclos iniciales. ^[76]
• Universal Fast Walking : para el recorrido genómico y la identificación genética mediante una PCR "bilateral" más específica que los enfoques "unilaterales" convencionales (que utilizan solo un cebador específico del gen y un cebador general, lo que puede generar "ruido" artificial) ^[77] en virtud de un mecanismo que implica la formación de una estructura en forma de lazo. Los derivados simplificados de UFW son LaNe RAGE (PCR anidada dependiente de lazo para la amplificación rápida de los extremos del ADN genómico), ^[78] 5'RACE LaNe ^[79] y 3'RACE LaNe. ^[80]

Historia

Representación esquemática de un par de cebadores de ejemplo. El uso de cebadores en un ensayo in vitro para permitir la síntesis de ADN fue una innovación importante que permitió el desarrollo de la PCR.

Las enzimas resistentes al calor, que son un componente clave en la reacción en cadena de la polimerasa, fueron descubiertas en la década de 1960 como producto de una forma de vida microbiana que vivía en las aguas sobrecalentadas del manantial Mushroom de Yellowstone . ^[81]

Un artículo de 1971 en el Journal of Molecular Biology escrito por Kjell Kleppe y sus colaboradores en el laboratorio de H. Gobind Khorana describió por primera vez un método de uso de un ensayo enzimático para replicar una plantilla corta de ADN con cebadores in vitro . ^[82] Sin embargo, esta manifestación temprana del principio básico de PCR no recibió mucha atención en ese momento y la invención de la reacción en cadena de la polimerasa en 1983 generalmente se atribuye a Kary Mullis . ^{[83] [ página necesaria ]}

"Baby Blue", un prototipo de máquina de 1986 para hacer PCR

Cuando Mullis desarrolló la PCR en 1983, trabajaba en Emeryville , California, para Cetus Corporation , una de las primeras empresas de biotecnología , donde era responsable de sintetizar cadenas cortas de ADN. Mullis ha escrito que concibió la idea de la PCR mientras conducía por la Pacific Coast Highway una noche en su coche. ^[84] Estaba jugando en su mente con una nueva forma de analizar los cambios (mutaciones) en el ADN cuando se dio cuenta de que, en cambio, había inventado un método para amplificar cualquier región del ADN a través de ciclos repetidos de duplicación impulsados ​​por la ADN polimerasa. En Scientific American , Mullis resumió el procedimiento: "Comenzando con una sola molécula del material genético ADN, la PCR puede generar 100 mil millones de moléculas similares en una tarde. La reacción es fácil de ejecutar. No requiere más que un tubo de ensayo, unos pocos reactivos simples y una fuente de calor". ^[85] La huella genética del ADN se utilizó por primera vez para las pruebas de paternidad en 1988. ^[86]

Mullis ha atribuido su uso del LSD como parte integral de su desarrollo de la PCR: "¿Habría inventado la PCR si no hubiera tomado LSD? Lo dudo seriamente. Podría sentarme sobre una molécula de ADN y ver pasar los polímeros. Aprendí eso en parte con drogas psicodélicas". ^[87]

Mullis y el bioquímico Michael Smith , que habían desarrollado otras formas esenciales de manipular el ADN, ^[1] recibieron conjuntamente el Premio Nobel de Química en 1993, siete años después de que Mullis y sus colegas de Cetus pusieran en práctica su propuesta por primera vez. ^[88] El artículo de 1985 de Mullis con RK Saiki y HA Erlich, "Amplificación enzimática de secuencias genómicas de β-globina y análisis de sitios de restricción para el diagnóstico de anemia de células falciformes" (la invención de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)), fue honrado con un premio Citation for Chemical Breakthrough Award de la División de Historia de la Química de la Sociedad Química Estadounidense en 2017. ^{[89] [2]}

El método PCR se basa en el uso de una ADN polimerasa adecuada capaz de soportar las altas temperaturas de >90 °C (194 °F) requeridas para la separación de las dos cadenas de ADN en la doble hélice de ADN después de cada ciclo de replicación . Las ADN polimerasas empleadas inicialmente para los experimentos in vitro previos a la PCR no podían soportar estas altas temperaturas. ^[2] Por lo tanto, los primeros procedimientos para la replicación del ADN eran muy ineficientes y consumían mucho tiempo, y requerían grandes cantidades de ADN polimerasa y una manipulación continua durante todo el proceso.

El descubrimiento en 1976 de la Taq polimerasa —una ADN polimerasa purificada de la bacteria termófila Thermus aquaticus , que vive naturalmente en ambientes cálidos (50 a 80 °C (122 a 176 °F)) ^[14] como las fuentes termales— allanó el camino para mejoras espectaculares del método de PCR. La ADN polimerasa aislada de T. aquaticus es estable a altas temperaturas y permanece activa incluso después de la desnaturalización del ADN, ^[15] eliminando así la necesidad de añadir nueva ADN polimerasa después de cada ciclo. ^[3] Esto permitió un proceso automatizado basado en termociclador para la amplificación del ADN.

Disputas sobre patentes

La técnica PCR fue patentada por Kary Mullis y cedida a Cetus Corporation , donde Mullis trabajaba cuando inventó la técnica en 1983. La enzima Taq polimerasa también estaba cubierta por patentes. Ha habido varias demandas de alto perfil relacionadas con la técnica, incluida una demanda fallida ^[90] presentada por DuPont . La empresa farmacéutica suiza Hoffmann-La Roche compró los derechos de las patentes en 1992. La última de las patentes comerciales de PCR expiró en 2017. ^[91]

En varias jurisdicciones del mundo todavía se está librando una batalla legal por la patente de la enzima Taq polimerasa ^entre Roche ^y Promega . Los argumentos jurídicos se han extendido más allá de la vigencia de las patentes originales de PCR y ^Taq polimerasa , que expiraron el 28 de marzo de 2005. ^[92]

Véase también

• Portal de biología

• Pruebas de COVID-19
• Pico de ADN
• Amplificación isotérmica mediada por bucle
• Técnica de selección
• Termo termófilo
• ADN polimerasa Pfu

Referencias

1. "El Premio Nobel de Química 1993". NobelPrize.org .
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Enlaces externos

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• ¿Qué es el efecto meseta de la PCR? Video tutorial de YouTube
• Historia de la reacción en cadena de la polimerasa según los archivos del Instituto Smithsonian