La re-referenciación del desplazamiento químico de proteínas es un proceso posterior a la asignación de ajuste de los desplazamientos químicos de RMN asignados para que coincidan con los estándares recomendados por la IUPAC y la BMRB en la referenciación del desplazamiento químico de proteínas . En RMN, los desplazamientos químicos normalmente se referencian a un estándar interno que se disuelve en la muestra de RMN. Estos estándares internos incluyen tetrametilsilano (TMS), ácido 4,4-dimetil-4-silapentano-1-sulfónico (DSS) y propionato de trimetilsililo (TSP). Para la espectroscopia de RMN de proteínas, el estándar recomendado es DSS , que es insensible a las variaciones de pH (a diferencia del TSP). Además, la señal DSS 1H se puede utilizar para referenciar indirectamente los desplazamientos de 13C y 15N utilizando un cálculo de proporción simple [1]. Desafortunadamente, muchos laboratorios de espectroscopia de RMN biomolecular utilizan métodos no estándar para determinar la posición del desplazamiento químico de "punto cero" de 1H , 13C o 15N . Esta falta de estandarización dificulta la comparación de los cambios químicos de la misma proteína entre distintos laboratorios. También dificulta el uso de los cambios químicos para identificar o asignar adecuadamente estructuras secundarias o para mejorar sus estructuras 3D mediante el refinamiento de los cambios químicos. La re-referenciación de cambios químicos ofrece un medio para corregir estos errores de referenciación y estandarizar la notificación de cambios químicos de proteínas en los distintos laboratorios.
La referenciación incorrecta de los desplazamientos químicos es un problema particularmente agudo en la RMN biomolecular. [1] Se ha estimado que hasta el 20% de las asignaciones de desplazamientos de 13C y hasta el 35% de las de 15N están referenciadas incorrectamente. [2] [3] [4] Dado que la información estructural y dinámica contenida en los desplazamientos químicos suele ser bastante sutil, es fundamental que los desplazamientos químicos de las proteínas se referencian correctamente para poder detectar estas diferencias sutiles. Fundamentalmente, el problema con la referenciación de los desplazamientos químicos proviene del hecho de que los desplazamientos químicos son mediciones de frecuencia relativa en lugar de mediciones de frecuencia absoluta. Debido a los problemas históricos con la referenciación de los desplazamientos químicos , los desplazamientos químicos son quizás los parámetros más medibles con mayor precisión pero los que se miden con menor precisión en toda la espectroscopia de RMN . [5] [3]
Debido a la magnitud y gravedad de los problemas con la referenciación por desplazamiento químico en la RMN biomolecular, se han desarrollado varios programas informáticos para ayudar a mitigar el problema (consulte la Tabla 1 para obtener un resumen). El primer programa que abordó de manera integral la referenciación errónea por desplazamiento químico en la RMN biomolecular fue SHIFTCOR. [2]
Tabla 1. Resumen y comparación de diferentes programas de detección de errores de asignación y re-referenciación de desplazamientos químicos . [5]
SHIFTCOR es un programa automatizado de corrección de desplazamiento químico de proteínas que utiliza métodos estadísticos para comparar y corregir desplazamientos químicos de RMN predichos (derivados de la estructura 3D de la proteína) en relación con un conjunto de entrada de desplazamientos químicos medidos experimentalmente. SHIFTCOR utiliza varios enfoques estadísticos simples y valores de corte predeterminados para identificar y corregir posibles errores de referencia, asignación y tipográficos . SHIFTCOR identifica posibles problemas de referencia de desplazamiento químico comparando la diferencia entre el valor promedio de cada conjunto de desplazamientos de la cadena principal observados (1Hα, 13Cα, 13Cβ, 13CO, 15N y 1HN) y sus correspondientes desplazamientos químicos predichos. La diferencia entre estos dos promedios da como resultado una compensación de desplazamiento químico específico del núcleo o una corrección de referencia (es decir, una para 1H , una para 13C y una para 15N). Para garantizar que ciertos valores atípicos extremos no sesguen indebidamente estos valores de compensación promedio, el promedio de los cambios observados solo se calcula después de excluir posibles asignaciones incorrectas o errores tipográficos . [2]
SHIFTCOR genera y reporta los desplazamientos o diferencias de desplazamiento químico para cada núcleo. Los resultados contienen los análisis de desplazamiento químico (incluidas las listas de posibles asignaciones incorrectas, los errores de referencia estimados, el error estimado en el desplazamiento de referencia calculado (intervalo de confianza del 95 %), el desplazamiento de referencia aplicado o sugerido, los coeficientes de correlación, los valores RMSD ) y el archivo de desplazamiento químico con formato BMRB corregido (consulte la Figura 1 para obtener más detalles). [2]
SHIFTCOR utiliza el programa de cálculo de desplazamiento químico SHIFTX [12] para predecir los desplazamientos de 1Hα, 13Cα, 15N basándose en las coordenadas de la estructura 3D de la proteína que se analiza. Al comparar los desplazamientos previstos con los desplazamientos observados, SHIFTCOR puede identificar con precisión los desplazamientos de referencia de desplazamiento químico , así como las posibles asignaciones incorrectas. Una limitación clave del enfoque SHIFTCOR es que requiere que la estructura 3D de la proteína objetivo esté disponible para evaluar los desplazamientos de referencia de desplazamiento químico. Dado que las asignaciones de desplazamiento químico se realizan normalmente antes de que se determine la estructura, pronto se comprendió que era necesario desarrollar enfoques independientes de la estructura. [5]
Se han desarrollado varios métodos que utilizan el contenido de estructura secundaria estimado (mediante desplazamientos de 1H o 13C ) o predicho (mediante secuencia) de la proteína que se analiza. Estos programas incluyen PSSI, [10] CheckShift, [6] [7] LACS, [4] [9] y PANAV. [11] Tanto PANAV <[1]> como CheckShift también están disponibles como servidores web.
Los programas PSSI y PANAV utilizan la estructura secundaria determinada por los desplazamientos de 1H (que casi nunca se referencian erróneamente) para ajustar los desplazamientos de 13C y 15N de la proteína objetivo para que coincidan con la estructura secundaria derivada de 1H. LACS utiliza la diferencia entre los desplazamientos secundarios de 13Cα y 13Cβ graficados contra los desplazamientos secundarios de 13Cα o los desplazamientos secundarios de 13Cβ para determinar los desplazamientos de referencia. Se ha adaptado una versión más reciente de LACS para identificar las referencias erróneas de los desplazamientos químicos de 15N. [4] Esta nueva versión de LACS explota la relación bien conocida entre los desplazamientos secundarios de 15N y los desplazamientos secundarios de 13Cα y 13Cβ del residuo precedente. [3] A diferencia de LACS y PANAV/PSSI, CheckShift utiliza la estructura secundaria predicha a partir de programas de predicción de estructura secundaria de alto rendimiento como PSIPRED [13] para ajustar iterativamente los desplazamientos químicos de 13C y 15N de modo que sus desplazamientos secundarios coincidan con la estructura secundaria predicha. Se ha demostrado que todos estos programas identifican con precisión los desplazamientos químicos de proteínas mal referenciados y vuelven a referenciar correctamente los desplazamientos químicos de proteínas depositados en el BMRB. [7] [11] Tenga en cuenta que tanto LACS como CheckShift están programados para predecir siempre el mismo desplazamiento para los desplazamientos de 13Cα y 13Cβ, mientras que PSSI y PANAV no hacen esta suposición. Como regla general, PANAV y PSSI suelen exhibir una dispersión menor (o desviación estándar ) en los desplazamientos de referencia calculados, lo que indica que estos programas son ligeramente más precisos que LACS o CheckShift. Ni LACS ni CheckShift pueden manejar proteínas que tienen desplazamientos de referencia extremadamente grandes (por encima de 40 ppm), mientras que PANAV y PSSI parecen poder manejar este tipo de proteínas anómalas. [11]
En un estudio reciente, [11] se ejecutó un programa de re-referenciación de desplazamiento químico (PANAV) en un total de 2421 entradas de BMRB que tenían una proporción suficiente (>80%) de desplazamientos químicos asignados para realizar una corrección de referencia de desplazamiento químico robusta. Se encontró un total de 243 entradas con desplazamientos de 13Cα compensados por más de 1,0 ppm, 238 entradas con desplazamientos de 13Cβ compensados por más de 1,0 ppm, 200 entradas con desplazamientos de 13C' compensados por más de 1,0 ppm y 137 entradas con desplazamientos de 15N compensados por más de 1,5 ppm. De este estudio, el 19,7% de las entradas en el BMRB parecen estar mal referenciadas. Evidentemente, la referenciación de desplazamiento químico sigue siendo un problema significativo y aún no resuelto para la comunidad de RMN biomolecular. [5] [11]