El operón L-arabinosa , también llamado operón ara o araBAD , es un operón necesario para la descomposición del azúcar de cinco carbonos L-arabinosa en Escherichia coli . [1] El operón L-arabinosa contiene tres genes estructurales : araB , araA , araD (conocidos colectivamente como araBAD ), que codifican tres enzimas metabólicas necesarias para el metabolismo de la L-arabinosa. [2] AraB ( ribuloquinasa ), AraA (una isomerasa ) y AraD (una epimerasa ) producidas por estos genes catalizan la conversión de L-arabinosa en un intermediario de la vía de las pentosas fosfato , D- xilulosa-5-fosfato . [2]
Los genes estructurales del operón L-arabinosa se transcriben a partir de un promotor común en un único transcrito , un ARNm . [3] La expresión del operón L-arabinosa está controlada como una sola unidad por el producto del gen regulador araC y el complejo proteína activadora del catabolito (CAP) -AMPc . [4] La proteína reguladora AraC es sensible al nivel de arabinosa y desempeña un doble papel como activador en presencia de arabinosa y represor en ausencia de arabinosa para regular la expresión de araBAD . [5] La proteína AraC no solo controla la expresión de araBAD sino que también autorregula su propia expresión en niveles altos de AraC. [6]
El operón L-arabinosa está compuesto de genes estructurales y regiones reguladoras, incluida la región operadora ( araO 1 , araO 2 ) y la región iniciadora ( araI 1 , araI 2 ). [7] Los genes estructurales, araB , araA y araD , codifican enzimas para el catabolismo de la L-arabinosa . También hay un sitio de unión de CAP donde el complejo CAP-AMPc se une y facilita la represión del catabolito , y da como resultado una regulación positiva de araBAD cuando la célula carece de glucosa . [8]
El gen regulador, araC , está situado aguas arriba del operón L-arabinosa y codifica la proteína reguladora AraC sensible a la arabinosa. Tanto araC como araBAD tienen un promotor discreto al que se une la ARN polimerasa e inicia la transcripción . [4] araBAD y araC se transcriben en direcciones opuestas desde el promotor araBAD ( P BAD ) y el promotor araC ( P C ) respectivamente. [2]
Tanto la L-ribulosa 5-fosfato como la D-xilulosa-5-fosfato son metabolitos de la vía de las pentosas fosfato , que vincula el metabolismo de los azúcares de 5 carbonos con el de los azúcares de 6 carbonos . [6]
El sistema L-arabinosa no sólo está bajo el control del activador CAP-cAMP, sino que también está regulado positiva o negativamente mediante la unión de la proteína AraC. AraC funciona como un homodímero , que puede controlar la transcripción de araBAD mediante la interacción con el operador y la región iniciadora del operón L-arabinosa. Cada monómero AraC está compuesto por dos dominios que incluyen un dominio de unión al ADN y un dominio de dimerización . [9] El dominio de dimerización es responsable de la unión de arabinosa. [10] AraC sufre un cambio conformacional tras la unión de arabinosa, en el cual tiene dos conformaciones distintas. [6] La conformación está determinada puramente por la unión del inductor alostérico arabinosa. [11]
AraC también puede autorregular negativamente su propia expresión cuando la concentración de AraC aumenta demasiado. La síntesis de AraC se reprime mediante la unión de AraC dimérico a la región operadora ( araO 1 ).
Cuando la arabinosa está ausente, las células no necesitan los productos ara BAD para descomponer la arabinosa. Por lo tanto, el AraC dimérico actúa como un represor: un monómero se une al operador del gen araBAD ( araO 2 ), otro monómero se une a un medio sitio distante del ADN conocido como araI 1 . [12] Esto conduce a la formación de un bucle de ADN. [13] Esta orientación impide que la ARN polimerasa se una al promotor araBAD . [14] Por lo tanto, se inhibe la transcripción del gen estructural araBAD . [15]
La expresión del operón araBAD se activa en ausencia de glucosa y en presencia de arabinosa. Cuando hay arabinosa presente, tanto AraC como CAP trabajan juntos y funcionan como activadores. [dieciséis]
AraC actúa como activador en presencia de arabinosa. AraC sufre un cambio conformacional cuando la arabinosa se une al dominio de dimerización de AraC. Como resultado, el complejo AraC-arabinosa se desprende del araO 2 y rompe el bucle de ADN. Por lo tanto, es energéticamente más favorable que AraC-arabinosa se una a dos medios sitios de ADN adyacentes: araI 1 y araI 2 en presencia de arabinosa. Uno de los monómeros se une a araI 1 , el monómero restante se une a araI 2 ; en otras palabras, la unión de AraC a araI 2 es inducida alostéricamente por la arabinosa. Uno de los monómeros AraC se coloca cerca del promotor araBAD en esta configuración, lo que ayuda a reclutar la ARN polimerasa al promotor para iniciar la transcripción. [17]
CAP actúa como activador transcripcional sólo en ausencia del azúcar preferido de E. coli , la glucosa. [18] Cuando no hay glucosa , un alto nivel de complejo de proteína CAP/AMPc se une al sitio de unión de CAP, un sitio entre araI 1 y araO 1 . [19] La unión de CAP/cAMP es responsable de abrir el bucle de ADN entre araI 1 y araO 2 , aumentando la afinidad de unión de la proteína AraC por araI 2 y promoviendo así que la ARN polimerasa se una al promotor araBAD para activar la expresión de AraBAD necesario para metabolizar la L-arabinosa.
La expresión de araC está regulada negativamente por su propio producto proteico, AraC. El exceso de AraC se une al operador del gen araC , araO 1 , en niveles elevados de AraC, lo que bloquea físicamente el acceso de la ARN polimerasa al promotor de araC . [20] Por lo tanto, la proteína AraC inhibe su propia expresión en altas concentraciones. [dieciséis]
El operón L-arabinosa ha sido un foco de investigación en biología molecular desde 1970, y ha sido investigado extensamente en sus niveles genético , bioquímico , fisiológico y biotécnico. [3] El operón L-arabinosa se ha utilizado comúnmente en el sistema de expresión de proteínas , ya que el promotor araBAD se puede utilizar para producir una expresión dirigida bajo una estricta regulación. Al fusionar el promotor araBAD con un gen de interés, la expresión del gen diana puede regularse únicamente mediante arabinosa: por ejemplo, el plásmido pGLO contiene un gen de proteína verde fluorescente bajo el control del promotor P BAD , lo que permite que la producción de GFP sea inducida por arabinosa.
Otros sistemas de operones en E. coli :
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