Se lleva a cabo un ensayo de run-on nuclear para identificar los genes que se están transcribiendo en un momento determinado. Se aíslan aproximadamente un millón de núcleos celulares y se incuban con nucleótidos marcados , y los genes en proceso de transcripción se detectan mediante la hibridación del ARN extraído con sondas específicas del gen en una mancha . [1] García-Martínez et al. (2004) [2] desarrollaron un protocolo para la levadura S. cerevisiae (Genomic run-on, GRO) que permite el cálculo de las tasas de transcripción (TR) para todos los genes de levadura para estimar las estabilidades del ARNm para todos los ARNm de levadura. [3]
Recientemente se han desarrollado métodos alternativos de microarrays, principalmente PolII RIP-chip: inmunoprecipitación de ARN de la ARN polimerasa II con anticuerpos dirigidos al dominio C-terminal fosforilados e hibridación en un portaobjetos o chip de microarrays (la palabra chip en el nombre proviene de "ChIP-chip" donde se requirió un GeneChip especial de Affymetrix ). Se ha realizado una comparación de métodos basados en run-on y ChIP-chip en levadura (Pelechano et al., 2009). Se ha detectado una correspondencia general de ambos métodos pero GRO es más sensible y cuantitativo. Se debe considerar que run-on solo detecta ARN polimerasas en elongación mientras que ChIP-chip detecta todas las ARN polimerasas presentes, incluidas las que retroceden.
La incorporación de una nueva ARN polimerasa a los genes se evita mediante la inclusión de sarkosyl . Por lo tanto, solo los genes que ya tienen una ARN polimerasa producirán transcripciones marcadas. Las transcripciones de ARN que se sintetizaron antes de la adición de la etiqueta no se detectarán porque carecerán de la etiqueta. Estas transcripciones de ejecución también se pueden detectar purificando las transcripciones marcadas mediante el uso de anticuerpos que detectan la etiqueta e hibridando estas transcripciones aisladas con matrices de expresión génica o mediante secuenciación de próxima generación (GRO-Seq). [4]
Los ensayos Run on han sido reemplazados en gran medida por ensayos Global Run on que utilizan la secuenciación de ADN de próxima generación como plataforma de lectura. Estos ensayos se conocen como GRO-Seq y proporcionan una vista increíblemente detallada de los genes involucrados en la transcripción con niveles cuantitativos de expresión. Los métodos basados en matrices para analizar los ensayos Global Run on (GRO) están siendo reemplazados por la secuenciación de próxima generación que elimina el diseño de sondas contra secuencias genéticas. La secuenciación catalogará todas las transcripciones producidas incluso si no se informan en las bases de datos. GRO-seq implica el etiquetado de las transcripciones recién sintetizadas con bromouridina (BrU). Las células o los núcleos se incuban con BrUTP en presencia de sarkosyl , que evita la unión de la ARN polimerasa al ADN. Por lo tanto, solo la ARN polimerasa que ya está en el ADN antes de la adición de sarkosyl producirá nuevas transcripciones que se etiquetarán con BrU. Las transcripciones marcadas se capturan con perlas marcadas con anticuerpos anti-BrU, se convierten en ADNc y luego se secuencian mediante secuenciación de ADN de próxima generación. Las lecturas de secuenciación se alinean luego con el genoma y la cantidad de lecturas por transcripción proporciona una estimación precisa de la cantidad de transcripciones sintetizadas. [5]