La mutagénesis por saturación de secuencia ( SeSaM ) es un método de mutagénesis aleatoria quimioenzimática aplicado para la evolución dirigida de proteínas y enzimas . [ cita requerida ] Es una de las técnicas de mutagénesis por saturación más comunes . En cuatro pasos de reacción basados en PCR , se insertan nucleótidos de fosforotioato en la secuencia del gen , se escinden y los fragmentos resultantes se alargan mediante nucleótidos universales o degenerados . Luego, estos nucleótidos se reemplazan por nucleótidos estándar, lo que permite una amplia distribución de mutaciones de ácidos nucleicos repartidas por la secuencia del gen con preferencia por las transversiones y con un enfoque único en mutaciones puntuales consecutivas, ambas difíciles de generar mediante otras técnicas de mutagénesis. La técnica fue desarrollada por el profesor Ulrich Schwaneberg en la Universidad Jacobs de Bremen y la Universidad RWTH de Aachen .
SeSaM se ha desarrollado para superar varias de las principales limitaciones encontradas al trabajar con métodos de mutagénesis estándar basados en técnicas de PCR propensas a errores simples (epPCR). Estas técnicas de epPCR se basan en el uso de polimerasas y, por lo tanto, encuentran limitaciones que resultan principalmente de la circunstancia de que solo se realizan sustituciones de ácidos nucleicos simples, pero muy raramente consecutivas [ cita requerida ] y que estas sustituciones ocurren generalmente solo en posiciones específicas favorecidas. Además, las transversiones de ácidos nucleicos son mucho menos probables que las transiciones y requieren polimerasas diseñadas específicamente con un sesgo alterado . [1] Estas características de los intercambios de ácidos nucleicos catalizados por epPCR junto con el hecho de que el código genético está degenerado disminuyen la diversidad resultante a nivel de aminoácidos . Las sustituciones sinónimas conducen a la preservación de aminoácidos o las mutaciones conservadoras con propiedades fisicoquímicas similares, como el tamaño y la hidrofobicidad, son muy frecuentes. [2] [3] Mediante la introducción no específica de bases universales en cada posición de la secuencia genética, SeSaM supera el sesgo de la polimerasa que favorece las sustituciones transitorias en posiciones específicas, pero abre la secuencia genética completa a una amplia gama de intercambios de aminoácidos. [4]
Durante el desarrollo del método SeSaM, se introdujeron varias modificaciones que permitieron la introducción de varias mutaciones simultáneamente. [5] Otro avance del método se logró mediante la introducción de bases degeneradas en lugar de inosina universal y el uso de ADN polimerasas optimizadas, lo que aumentó aún más la proporción de transversiones introducidas. [6] Este método SeSaM-TV+ modificado además permite y favorece la introducción de dos intercambios de nucleótidos consecutivos, ampliando fuertemente el espectro de aminoácidos que pueden sustituirse.
Mediante varias optimizaciones, incluida la aplicación de una polimerasa quimera mejorada en el Paso III del método SeSaM-TV-II [7] [8] y la adición de un nucleótido degenerado alternativo para la sustitución eficiente de bases de timina y citosina y una mayor frecuencia de mutación en SeSaM-P/R, [9] las bibliotecas generadas se mejoraron aún más con respecto al número de transversión y el número de mutaciones consecutivas se elevó a 2-4 mutaciones consecutivas con una tasa de mutaciones consecutivas de hasta el 30%. [10]
El método SeSaM consta de cuatro pasos basados en PCR que pueden ejecutarse en dos o tres días. Las partes principales incluyen la incorporación de nucleótidos fosforotioatos, la fragmentación química en estas posiciones, la introducción de bases universales o degeneradas y su reemplazo por nucleótidos naturales insertando mutaciones puntuales.
Inicialmente, se insertan secuencias universales “SeSaM” mediante PCR con cebadores específicos de genes que se unen por delante y por detrás del gen de interés. El gen de interés con sus regiones flanqueantes se amplifica para introducir estas secuencias SeSaM_fwd y SeSaM_rev y generar una plantilla para los pasos de PCR posteriores.
Estas denominadas plantillas fwd y rev generadas se amplifican ahora en una reacción de PCR con una mezcla predefinida de nucleótidos fosforotioato y estándar para garantizar una distribución uniforme de las mutaciones insertadas en toda la longitud del gen. Los productos de PCR del Paso 1 se escinden específicamente en los enlaces fosforotioato, lo que genera un conjunto de fragmentos de ADN monocatenario de diferentes longitudes a partir del cebador universal.
En el paso 2 de SeSaM, las cadenas simples de ADN se alargan mediante una o varias bases universales o degeneradas (según la modificación de SeSaM aplicada), catalizadas por la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT). Este paso es el paso clave para introducir las mutaciones consecutivas características para mutar aleatoriamente codones enteros.
Posteriormente, en el Paso 3 se realiza una PCR recombinando los fragmentos de ADN monocatenario con el molde inverso de longitud completa correspondiente, generando el gen bicatenario de longitud completa incluyendo bases universales o degeneradas en su secuencia.
Al reemplazar las bases universales/degeneradas en la secuencia genética por nucleótidos estándar aleatorios en el paso 4 de SeSaM, se genera una variedad diversa de secuencias genéticas de longitud completa con mutaciones de sustitución, incluida una gran carga de transversiones y mutaciones de sustitución posteriores.
SeSaM se utiliza para optimizar directamente las proteínas a nivel de aminoácidos, pero también para identificar preliminarmente las posiciones de aminoácidos para probar en mutagénesis de saturación para el intercambio ideal de aminoácidos. SeSaM se ha aplicado con éxito en numerosas campañas de evolución dirigida de diferentes clases de enzimas para su mejora hacia propiedades seleccionadas como la celulasa para la resistencia a líquidos iónicos, [11] proteasa con mayor tolerancia a detergentes, [12] glucosa oxidasa para aplicación analítica, [13] fitasa con mayor termoestabilidad [14] y monooxigenasa con eficiencia catalítica mejorada utilizando donantes de electrones alternativos. [15] SeSaM está protegida por patente US770374 B2 en más de 13 países y es una de las tecnologías de plataforma de SeSaM-Biotech GmbH .