La microespectroscopia anisotrópica de terahercios ( ATM ) es una técnica espectroscópica en la que se analizan las vibraciones moleculares en un material anisotrópico con pulsos cortos de radiación de terahercios cuyo campo eléctrico está polarizado linealmente en paralelo a la superficie del material. La técnica se ha demostrado en estudios que involucran cristales monocristalinos de sacarosa, fructosa, ácido oxálico y proteínas moleculares en los que la orientación espacial de las vibraciones moleculares es de interés.
Cuando el campo eléctrico de un haz de luz que se propaga oscila en una dirección perpendicular a su dirección de propagación, se dice que es una onda transversal polarizada . La luz con un campo eléctrico restringido a un ángulo particular en el plano transversal se dice que está polarizada linealmente. Cuando la luz polarizada linealmente se transmite a través de un material isótropo (un material que exhibe las mismas propiedades físicas en todas las direcciones espaciales), la cantidad de luz absorbida por el material es la misma cuando se mide para todos los ángulos de la luz polarizada. El espectro de absorbancia resultante no tiene características distintivas como función del ángulo de polarización.
Un material que se considera anisotrópico exhibe diferentes propiedades físicas, como absorbancia, índice de refracción, conductividad, etc., a lo largo de diferentes direcciones espaciales. Por lo tanto, cuando un haz de luz polarizado linealmente pasa a través de un material anisotrópico y se mide para diferentes ángulos de polarización, la absorción de la luz es diferente para diferentes ángulos de polarización. El espectro de absorbancia resultante exhibe diversos grados de absorbancia que corresponden al grado de anisotropía del material.
Cuando un haz de luz polarizado de THz se transmite a través de un material anisotrópico, el espectro de absorbancia resultante exhibe diversos grados de absorbancia que corresponden a la anisotropía del material. Si se realizan mediciones a diferentes frecuencias a lo largo del espectro de THz (entre aproximadamente 0,3 a 3 THz) en un ángulo de polarización de THz particular, el espectro de absorbancia resultante también puede variar con la frecuencia. Esto ocurre porque los modos vibracionales de las moléculas en el material absorben luz a diferentes frecuencias. En las moléculas de proteínas, por ejemplo, muchos de estos modos vibracionales oscilan dentro del rango de frecuencias de terahercios. Cuando las moléculas de un material están dispuestas en la misma orientación, las propiedades vibracionales internas de las moléculas pueden identificarse utilizando microespectroscopia de terahercios anisotrópica (ATM). Esta alineación molecular se encuentra en monocristales de sacarosa, fructosa, ácido oxálico y otros cristales moleculares como los cristales de proteínas .
Hasta la fecha, las técnicas ATM han utilizado espectroscopia de dominio temporal de THz (THz-TDS) debido a la escasez histórica de fuentes de THz potentes y detectores de THz de alta sensibilidad que funcionen a temperatura ambiente. Muchas muestras de interés contienen grandes cantidades de agua que absorben fuertemente la radiación de THz, por lo que requieren una fuente de THz muy potente. Este requisito se ve exacerbado cuando se intenta utilizar detectores de THz de alta sensibilidad que, convencionalmente, requieren un sobreenfriamiento a temperaturas de helio líquido. Peor aún, la necesidad de sobreenfriar estos detectores ha hecho que la detección de THz no esté disponible para muchos investigadores de todo el mundo debido a los recientes aumentos bruscos del precio del helio líquido debido a su escasez.
Para sortear los obstáculos de detección de THz, se utiliza THz-TDS, ya que requiere detectores infrarrojos comúnmente disponibles sensibles en la región del infrarrojo cercano del espectro electromagnético, más comúnmente alrededor de una longitud de onda de 800 nm. En este caso, un cristal electroóptico (EO), como nitruro de galio (GaN) o telururo de zinc (ZnTe), se utiliza comúnmente para detectar cambios en la luz THz después de que ha pasado a través de una muestra. Las propiedades de polarización de un haz de luz infrarrojo sincronizado que pasa a través del cristal EO se modifican. Este cambio de polarización se detecta mediante un detector infrarrojo, llamado detector equilibrado, que compara la magnitud de dos componentes de polarización perpendiculares del haz infrarrojo.
Hasta que se desarrollen fuentes de THz más potentes que proporcionen un amplio rango de frecuencias y detectores de THz a temperatura ambiente más sensibles, THz-TDS sigue siendo una técnica confiable para ATM.
Las técnicas THz-TDS utilizadas en ATM pueden dividirse en dos categorías: muestra rotada y muestra estacionaria. Históricamente, la primera técnica implicaba la rotación de la muestra en el foco de un haz THz mientras el detector se colocaba lejos de la muestra en el campo lejano . Sin embargo, por muchas razones mecánicas, se prefiere una técnica de muestra estacionaria. En ATM de muestra estacionaria, un haz THz polarizado se rota 360° en un plano perpendicular a la dirección de propagación del haz y, por lo general, utiliza un esquema de detección de campo cercano en el que la muestra se monta en contacto directo con un cristal EO que posteriormente se analiza mediante el haz infrarrojo en una configuración THz-TDS.
Las técnicas ATM originales implican la rotación de la muestra en el punto focal de un haz de THz polarizado linealmente utilizando un soporte de muestra rotado mecánicamente. Por este motivo, la configuración es típicamente un instrumento de campo lejano en el que se coloca un detector balanceado (sensible a la luz infrarroja) a una distancia considerable de la muestra. En la configuración de espectroscopia de dominio temporal de terahercios, tanto el haz de infrarrojos como el de THz se transmiten a través de un cristal electroóptico (EO) como ZnTe o GaP. Aquí, el haz de infrarrojos detecta el cambio en la birrefringencia del cristal de EO debido al haz de THz. Cuando se coloca una muestra en el haz de THz, el haz de THz polarizado se perturba y el grado resultante de birrefringencia en el cristal de EO cambia. La perturbación resultante del haz de infrarrojos se detecta en el detector balanceado.
La rotación de la muestra ATM es muy útil para muestras grandes (de 0,1 a 1 cm). Sin embargo, cuando se miden muestras como cristales de proteínas que deben aislarse dentro de una cámara de hidratación, por ejemplo, la muestra no se puede rotar fácilmente. Además, es difícil mantener la misma ubicación de una muestra rotada en el punto focal preciso de un haz de THz.
Un cajero automático diseñado con una muestra rotada es típicamente una configuración de medición de campo lejano que utiliza una estrategia de espectroscopia de dominio temporal.
Generalmente se utiliza un láser infrarrojo de alta potencia, cuyo haz se divide mediante un divisor de haz en dos trayectorias ópticas: un haz de sonda y un haz de generación de THz.
El haz de generación de THz normalmente recibe la mayor fracción de potencia NIR para maximizar la potencia de la luz THz generada comúnmente por una antena fotoconductora pulsada por voltaje. La luz THz generada se recoge a través de una lente de silicio hiperhemisférico y pasa a un espejo parabólico fuera del eje que colima el haz THz para polarizarlo mediante un polarizador THz que a menudo está hecho de una simple rejilla de alambre . El haz THz polarizado linealmente se enfoca luego mediante un segundo espejo parabólico fuera del eje sobre la muestra. El haz THz transmitido a través de la muestra es nuevamente recogido por un tercer espejo parabólico fuera del eje, colimado sobre un cuarto espejo parabólico que luego enfoca el haz sobre un cristal electroóptico (EO) cuya birrefringencia se ve perturbada por la fuerza del haz THz.
El haz de sonda NIR pasa a través del cristal EO para sondear el grado de birrefringencia inducido causado por el haz THz y pasa a un módulo de detección que a menudo consta de una placa de cuarto de onda NIR, un prisma de Wollaston que separa espacialmente los estados de polarización ortogonal del haz de sonda en dos trayectorias ópticas que se detectan individualmente en un detector equilibrado. La señal resultante informada por el detector equilibrado es una medida de la diferencia de magnitud de estos dos componentes ortogonales del haz de sonda NIR y, por lo tanto, una correlación directa del grado de birrefringencia inducido en el cristal EO por el haz THz que pasa a través de la muestra.
Anteriormente denominada "ATM ideal" y "ATM con polarización variable", [2] la ATM de muestra estacionaria (SSATM) implica la rotación del estado polarizado linealmente del haz de THz en una configuración de espectroscopia de dominio temporal (TDS) paralela a la muestra de material interrogada. En una configuración SSATM, la polarización del haz de THz se rota 360° en un plano perpendicular a la dirección de propagación del haz. Las mediciones de la anisotropía de la muestra se miden en varios ángulos de polarización de THz.
Se han demostrado al menos dos métodos para lograr la rotación de polarización THz para SSATM: 1) utilizando una placa de cuarto de onda THz (THz-QWP) junto con un polarizador infrarrojo [3] y 2) rotando la antena fotoconductora. [4]
En el caso de emplear un THz-QWP y un polarizador infrarrojo, la magnitud de la señal medida, , donde es un retraso de tiempo entre la generación de THz y los pulsos detectados en un sistema THz-TDS depende del ángulo de polarización relativo de la luz THz, y el ángulo de polarización del haz de sonda de infrarrojo cercano (NIR) ultrarrápido, , en la muestra por la relación [5] El objetivo es mantener la misma magnitud del campo eléctrico THz en la muestra para todos los ángulos de medición, . Esto requiere el ajuste de para cada .
Un instrumento SSATM normalmente está diseñado en una configuración de espectroscopia de dominio temporal en la que un haz láser infrarrojo de alta potencia se divide en dos trayectorias ópticas mediante un divisor de haz.
El primer camino óptico suele recibir una fracción mayor de la potencia óptica del láser para maximizar la potencia de salida de la luz THz generada. La luz THz se genera a menudo con una antena fotoconductora pulsada por voltaje, se recoge con una lente de silicio hiperhemisférico, se colima utilizando un espejo parabólico fuera del eje que luego pasa a través de un polarizador THz, que se hace circular mediante una placa de cuarto de onda THz construida con dos espejos planos y un prisma de silicio de alta resistividad en ángulo recto para formar luz polarizada circularmente. Un segundo polarizador THz selecciona de la luz THz polarizada circularmente el ángulo en el que se realiza cada medición una vez que la luz llega a una muestra ubicada en un punto focal del haz y montada en contacto directo con un cristal electroóptico a menudo hecho de ZnTe o GaP.
La segunda trayectoria óptica incluye un espejo retrorreflector montado en una etapa de retardo que ajusta el tiempo de vuelo del haz NIR para que coincida con el tiempo de retardo, , de la luz THz en la muestra. El haz NIR está polarizado linealmente y cortado a una frecuencia adecuada para la detección, dirigido al cristal EO para medir el cambio en su birrefringencia debido al grado de absorción de THz por la muestra. El haz NIR es reflejado por la interfaz de muestra/cristal EO y dirigido al módulo de detección que a menudo consta de una placa de cuarto de onda NIR, un prisma Wollaston que selecciona espacialmente estados de polarización perpendicular de la luz hacia dos detectores en un detector equilibrado. La señal detectada es una medida de la diferencia de la magnitud de los dos estados de polarización perpendicular y corresponde al grado de birrefringencia inducido en el cristal EO por la luz THz perturbada por la muestra.
Una estrategia para proporcionar una rotación completa de 360° de polarización THz de magnitud de campo eléctrico igual en la muestra es generar un estado circular de polarización y luego seleccionar estados de polarización lineal particulares del haz polarizado circularmente con un polarizador THz.
Un estado de polarización circular puede generarse mediante una placa de cuarto de onda, sin embargo, las placas de onda ópticas comunes están diseñadas típicamente para regiones visibles, cercanas e infrarrojas medias del espectro electromagnético. Una placa de cuarto de onda diseñada para usarse en el rango de frecuencia de THz consiste en un prisma de silicio en ángulo recto junto con espejos planos revestidos de metal como entrada/salida. En particular, el prisma de silicio actúa de manera análoga a un rombo de Fresnel con una única reflexión interna total en la cara más larga del prisma y es un componente pasivo de banda ancha que permite un amplio barrido de frecuencia durante las mediciones.
Algunas ventajas de la ATM sobre otras técnicas de microespectroscopia relacionadas incluyen la orientación del campo eléctrico THz en la muestra y la capacidad de medir fácilmente materiales que son sensibles a las condiciones ambientales como la hidratación, el crioenfriamiento y la evacuación.
Una característica clave de la ATM es la orientación del campo eléctrico polarizado de la luz THz en la muestra. En particular, a diferencia de otras técnicas de microespectroscopia como la microscopía óptica de campo cercano con barrido por dispersión (s-SNOM), el campo eléctrico del campo THz de interrogación es paralelo a la superficie de la muestra. En s-SNOM, la forma de la punta de la sonda metálica oscilante dirige la polarización THz en una dirección predominantemente perpendicular a la superficie de la muestra.
Los organismos vivos suelen estar compuestos por grandes cantidades de agua. Muchos materiales anisotrópicos de interés son de naturaleza biológica y, como tales, requieren hidratación durante las mediciones espectroscópicas. Si bien recientemente se han publicado algunas técnicas novedosas y limitadas para medir las propiedades de los materiales dentro de una cámara de muestra hidratada, el requisito de diseño principal de la ATM es que el material sea accesible a través de una ventana que sea transparente a la luz de THz, como el cuarzo. De manera similar, las muestras que requieren crioenfriamiento o un entorno de vacío a baja presión se pueden analizar fácilmente en la ATM utilizando materiales con ventanas transparentes a THz.
La microespectroscopia de terahercios anisotrópica (ATM) ha encontrado aplicaciones en biología estructural y en la identificación molecular de ADN y proteínas. [8] La técnica también es adecuada para el descubrimiento de fármacos y el estudio de las propiedades de frecuencia de THz de materiales de estado sólido de película delgada .
Se presta especial atención a los movimientos moleculares en las proteínas, donde se producen muchos cambios estructurales a frecuencias en el rango de los terahercios del espectro (0,3 THz a 3 THz). Estos cambios estructurales incluyen movimientos de bisagra en los que dos regiones de moléculas están conectadas entre sí por una estructura molecular flexible que se dobla como una bisagra mecánica o un codo . ATM es excepcionalmente capaz de medir la dirección espacial en la que se producen los movimientos de bisagra debido a su uso de campos eléctricos polarizados linealmente.
La ATM es especialmente adecuada para medir vibraciones moleculares resonantes en proteínas. [9] Los movimientos moleculares en las proteínas ocurren con frecuencias en el rango de terahercios del espectro (0,3 THz a 3 THz). Estos cambios estructurales incluyen movimientos de bisagra en los que dos regiones de moléculas están conectadas entre sí de una manera flexible que se dobla como una bisagra o articulación mecánica y otros cambios conformacionales que ocurren dentro de los sistemas de moléculas de proteínas.
Las moléculas de proteínas suelen estar rodeadas de moléculas de agua y se disponen en orientaciones aleatorias. Por este motivo, es habitual disponer las moléculas de proteínas en forma de cristal de forma que sus orientaciones sean las mismas. En particular, en un cristal de proteína, los dipolos de todas las moléculas de proteína están alineados de forma natural. Esto nos permite realizar microespectroscopia con luz polarizada THz y determinar la orientación espacial de las vibraciones dentro de las moléculas.
![{\displaystyle {\rm {Sig}}(\tau ,\alpha _{\rm {THz}},\phi _{\rm {NIR}})\propto \left|\left[\cos(\alpha _{\rm {THz}})\sin(2\phi _{\rm {NIR}})+2\sin(\alpha _{\rm {THz}})\cos(2\phi _{\rm {NIR}})\right]\right|.}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/6ff7e2f9cac9d96cf6d91dfc5ccadc484736af51)