Los microARN miR-92 son fragmentos cortos de ARN monocatenario no codificante de proteínas descubiertos inicialmente incorporados en un complejo RNP con una función propuesta de procesamiento de moléculas de ARN y posterior ensamblaje de RNP. Mir-92 ha sido mapeado en el genoma humano como parte de un grupo más grande en el cromosoma 13q31.3 , [1] donde tiene 22 nucleótidos de longitud pero existe en el genoma como parte de una secuencia precursora más larga . Hay una réplica exacta del precursor mir-92 en el cromosoma X. [2] Los microARN son desencadenantes endógenos de la vía RNAi que involucra varias proteínas ribonucleicas (RNP) dedicadas a reprimir moléculas de ARNm a través de la inhibición de la traducción y/o la inducción de la escisión del ARNm. [2] Los miARN son madurados a partir de sus precursores de ARN largos por proteínas ribonucleicas como parte de un mecanismo de biogénesis de 2 pasos que involucra a la ARN polimerasa 2. [ 3]
La mayoría de los miRNA se agrupan en grupos en el genoma humano o dentro de familias que comparten funciones, perfiles de expresión, promotores o están incorporados en la misma proteína ribonucleica. El propósito de tener una variedad de miRNA en una sola pieza de la maquinaria de procesamiento de ARN es actuar como cadenas complementarias a los elementos de reconocimiento de una variedad de moléculas de ARN objetivo. [2]
Los elementos de reconocimiento de los ARNm objetivo se encuentran normalmente dentro de las regiones 3' no traducidas [4] y con 678 miRNA humanos y 472 miRNA de ratón identificados con seguridad hasta el momento (miRBASE) [5] se están realizando amplios esfuerzos utilizando herramientas bioinformáticas para escanear genomas en busca de posibles elementos de reconocimiento para familias de miRNA con el fin de identificar posibles genes objetivo.
El mir-92 no es una excepción y los genes diana identificados hasta el momento se encuentran entre los implicados en la regulación del ciclo celular y la señalización celular, y por tanto son necesarios durante todas las etapas del desarrollo de los mamíferos y esenciales para la proliferación de las células. [3] [6] Los miRNA pueden ser oncogenes o genes supresores de tumores dependiendo de sus objetivos, mientras que el mir-92 ha sido implicado como el primero en formas de leucemia LMA y LLA , carcinoma hepatocelular (HCC) y varios otros tipos de cáncer. [1] [6]
La búsqueda de herramientas no invasivas para el diagnóstico y el tratamiento del cáncer es extremadamente importante para reducir la carga mundial de la enfermedad. Los microARN muestran potencial como biomarcadores e incluso se los puede encontrar circulando en el suero. Algunos microARN circulantes son específicos de pacientes con tumores, mientras que el miR-92, por otro lado, está presente en individuos sanos en el suero, pero los niveles son variables y parecen cambiar en respuesta a la aparición de algunos cánceres. [6]
El miR-92 es parte de una gran secuencia precursora que forma un bucle de tallo una vez transcrito en ARN. Esta larga secuencia precursora es un componente del grupo mir-17-92 que contiene 5 secuencias precursoras de mir adicionales: mir-17 , mir-18a, mir-19a , mir-20a y mir19b-1. [4] Los componentes tienen funciones relacionadas y también existen en su forma madura como parte de los complejos RNP. [2] El grupo se llama Oncomir-1 porque todos los miembros se han relacionado con la inducción de una mayor proliferación celular y la supresión de la apoptosis. [4] Oncomir-1 tiene 2 parálogos, miR-106a-363 y mir-106b-25. Estos se encuentran en diferentes cromosomas y contienen miRNA individuales que son muy similares a los codificados por el grupo mir-17-92. [7] Por ejemplo, el mir-92-1 aparece en el grupo mir-17-92 y el mir-92-2 aparece en el grupo mir-106a-363. Debido a que tienen secuencias idénticas en su forma madura, no siempre es posible establecer cuál es el más importante en una muestra simplemente secuenciando el pequeño contenido de ARN. [3] Es probable que los miRNA de oncomir-1 y sus parálogos contribuyan a la tumorogénesis al desregular genes diana críticos, como los que participan en la apoptosis, la proliferación y el bloqueo de la diferenciación o la salida del ciclo celular. [3]
El grupo miR-17-92 se ha visto implicado en el meduloblastoma (MB), que es el tumor cerebral maligno pediátrico más común. [3] Surge cuando las células progenitoras de neuronas granulares (GNP) del cerebelo no migran ni se diferencian adecuadamente. El MB puede ser inducido por dos síndromes de cáncer hereditario, uno de los cuales se denomina síndrome de Gorlin y está causado por un gen PATCHED (PTCH) mutado . PTCH es el receptor de Sonic hedgehog (SHH). Esta vía de señalización de SHH es crucial durante el desarrollo temprano y SSH es el principal mitógeno para la proliferación de GNP. [3] El síndrome de Turcot también puede dar lugar a MB, como resultado de un gen de poliposis adenomatosa coli (APC) mutado (un miembro de la vía de señalización de wingless (WNT). Pero se cree que solo el síndrome de Gorlin y la vía de SHH incorporan el modo de acción del grupo miR-17-92.
Los patrones de expresión de muchos miRNA son específicos del momento y del órgano, especialmente aquellos involucrados en la regulación del desarrollo. Las bibliotecas de miRNA construidas a partir de la clonación y secuenciación de ARN cortos derivados de cultivos de células madre embrionarias de ratón han demostrado que se expresa miR-92. Estas células totipotentes representan las primeras etapas del desarrollo de los mamíferos (se derivan de las células internas del blastocisto [8] ). Sin embargo, mir-92 también estaba presente en bibliotecas construidas a partir de células completamente diferenciadas de cuatro días de edad, así como en bibliotecas construidas a partir de tejidos adultos. Se propone que un miRNA que permanece constante en su expresión a través de estas etapas tiene un papel en la regulación de aspectos generales de la fisiología celular. [8] Por lo tanto, se estaba volviendo evidente en 2003, poco después de su descubrimiento, que el miRNA mir-92 y los miembros de la familia asociados están proporcionando roles funcionales al ciclo celular y a la señalización celular, y a la fisiología celular general.
Como hay un número relativamente pequeño de miRNA codificados en el genoma humano en comparación con el número de genes codificadores de proteínas, los miRNA se están convirtiendo en los biomarcadores de elección para caracterizar el estado de una muestra de tejido o célula. Además, no hay marcadores de ARNm que muestren una expresión diferencial consistente entre tumores y tejidos normales, pero el perfil de todos los miRNA ha demostrado ser mucho más informativo con respecto al diagnóstico del cáncer y sus orígenes evolutivos. [9] El grado de expresión diferencial de los miRNA es incluso lo suficientemente alto como para que la agrupación jerárquica haya permitido solicitar muestras dentro de un único linaje de desarrollo que refleje mecanismos de transformación y proporcione huellas dactilares de miRNA que codifiquen el desarrollo de cánceres humanos típicos. [9] Como mir-92 se expresa en la mayoría de las células en todo momento, sus perfiles de expresión formarán una parte confiable del diagnóstico y la detección de enfermedades. miR-92a también está presente en el plasma sanguíneo de los humanos junto con otros 91 miRNA. [10]
Se ha demostrado que el nivel de miR-92a en la circulación refleja la aparición de ciertos tipos de leucemia (véase la sección de evidencia experimental).
Como los elementos de reconocimiento de miR se encuentran típicamente en el UTR 3' del ARNm del gen diana, la bioinformática por sí sola puede identificar posibles dianas de miR-92 utilizando recursos como la base de datos miRGen. En un informe, el software miRanda encontró 300 genes diferentes que tienen supuestos sitios de unión de miR-92a conservados entre Homo sapiens, Mus musculus y Rattus norvegicus en las regiones UTR 3' de sus transcripciones. [1] Dos genes que se destacaron por estos medios fueron ERβ y MUC16 . [4] La regulación negativa de los receptores de estrógeno β1 y α se ha asociado con varias formas de cáncer de mama. Si bien el modo de acción de ERα no está bien establecido, hay evidencia sólida que respalda un papel para miR-92 dentro de la vía reguladora de ERβ1. [4] El perfil de diferentes líneas celulares de cáncer de mama contra líneas celulares de control no cancerosas demostró una relación inversa significativa entre la expresión de ERβ1 y miR-92. En concreto, las líneas celulares de cáncer de mama MCF-7 transfectadas con anti-miR-92 mostraron un aumento de ERβ1, mientras que la transfección con pre-miR-92 dio lugar a una regulación negativa de ERβ1. De forma similar, y como experimento secundario, la inhibición de miR-92 tuvo una acción equivalente a la de restaurar la expresión de MUC16 en el mismo tipo de célula. [4] Se obtuvieron más pruebas al transfectar células MCF-7 con un reportero GFP clonado para contener la región 3' UTR de ERβ1. La citometría de flujo reveló un aumento significativo de la fluorescencia verde tras la transfección con anti-miR-92. Esta evidencia sugiere que miR-92 se dirige tanto al ARNm de ERβ1 como al de MUC16 y, al hacerlo, suprime su expresión. [4]
El miRNA miR-92 se aisló por primera vez del lisado de células Hela de una partícula de sedimento ~15S. Era un miembro de un grupo de otros 40 miRNA y dos proteínas clave que forman una proteína ribonucleica análoga al complejo proteico SMN. [2] SWN tiene un papel en el ensamblaje y procesamiento de RNP adicionales. Las deleciones y la pérdida de función del complejo SMN se han correlacionado con la enfermedad neurodegenerativa atrofia muscular espinal. [11] También presente en el mismo pico de cosedimento estaba la proteína eIF2C2 perteneciente a la familia Argonaute. Los Argonautes están involucrados en la regulación de la expresión génica a través de la interferencia del ARN. [12]
Como se ha comentado, existen pruebas que respaldan la utilización del miR-92 plasmático como biomarcador para la detección de la leucemia. Se llegó a esta conclusión tras un análisis de microarrays del plasma sanguíneo de pacientes con leucemia frente a muestras sanas. Aunque los perfiles de expresión generales no fueron significativamente diferentes, el orden de intensidad de unos pocos ARN pequeños clave cambió lo suficiente como para fomentar la atención y el análisis específico. El miR-92 fue uno de ellos. [6] La RT-PCR confirmó una regulación negativa del miR-92a en pacientes con leucemia mieloide aguda y leucemia linfoblástica aguda. El miR-92a se expresa fuertemente en las propias células leucémicas y no se detecta expresión en blastos normales ( hibridación in situ ). [6] Esto parece contraintuitivo, en primer lugar porque no hay una fuente obvia para la producción o el mantenimiento del miARN en el plasma sanguíneo y, en segundo lugar, porque parece haber una relación inversa entre los niveles de miR-92 en células leucémicas y los niveles de miR-92 en el plasma sanguíneo de los pacientes con la enfermedad. Hay 91 miRNA presentes en el plasma humano [10] y se ha propuesto que el miR-92a, junto con otros miR típicos del suero, como el miR-638, se encuentran empaquetados dentro de exosomas que son secretados por las células. Para que los miRNA existan en el plasma, deben estar en una forma que sea resistente a la actividad de la ARNasa [10] y esto podría lograrse desde dentro de los exosomas. Dado que hemos establecido que el miR-92 es una característica tan destacada en muchos cánceres, es tentador concluir que las células cancerosas pueden absorber los exosomas para complementar la cantidad de miR-92a expresado localmente. [6] El resultado de esta acción sería una disminución correspondiente del miR-92a en el plasma sanguíneo.
La evidencia que apoya el papel del miR-92 en el cáncer hepatocelular (CHC) se obtuvo a partir de experimentos de hibridación in situ de tumores. [1] La sobreexpresión del miR-92 fue bien pronunciada en función del sexo, la edad, el tipo de virus, el estadio clínico y el estadio de diferenciación del tumor, lo que convierte al miR-92 en un posible biomarcador sólido para el CHC. La transfección de líneas celulares de CHC humano con antagomir anti-miR-92a (cadena de ARN complementaria que desencadena la depleción del miARN diana [13] ) redujo la tasa de proliferación de la línea celular en comparación con la transfección con un oligonucleótido de control. [1] Siguiendo un principio similar a la captación propuesta de miR-92 por las células leucémicas (véase más arriba), la transfección con miR-92a adicional aumentó la tasa de proliferación de 2 de las 3 líneas celulares cancerosas que ya estaban proliferando. [1]
Como se ha comentado, se ha propuesto que el grupo mir-17-92 tiene una relación funcional con la señalización Patched, cuyo funcionamiento anormal puede inducir los tumores GNP típicos del meduloblastoma. Se llegó a esta hipótesis tomando perfiles de expresión de miRNA de células tumorales similares a GNP de ratones mutantes. [3] Hay varios ratones mutantes knock out que muestran un desarrollo espontáneo de MB a los 5 meses de vida. Forman un grupo clásico para el estudio del meduloblastoma y otros cánceres e incluyen líneas de ratones que son KO para p53 , Ptch1 e Ink4c. De los 26 miRNA que mostraron niveles de expresión más altos (en uno de los grupos mutantes) contra ratones de tipo salvaje, 9 de ellos eran del grupo mir-17-92 y sus 2 parálogos. Los cambios generales de la firma en los grupos mutantes y los grupos de control fueron en gran medida insignificantes y el grupo mir-17-92 solo estuvo implicado en ratones mutantes que tenían una vía SHH activa. [3] Estas observaciones merecieron un mayor enfoque en el grupo y se utilizó la PCR-QRT para medir la expresión del grupo oncogénico en muestras de tumores MB con mayor precisión. La sobreexpresión fue particularmente pronunciada para miR-92 y miR20a. De manera similar, estas tendencias solo estaban presentes en tumores cuyos perfiles de expresión revelaron una vía SHH activada. [3]
La implicación es que el miR-92 y otros miRNAs de mir-17-92 impulsan la formación de MB humano al actuar sobre la vía SHH/PTCH. En estudios posteriores con ratones, un inhibidor de la vía SHH (medicamento ciclopamina) fue suficiente para reducir la proliferación de células tumorales que habían sido infectadas con un retrovirus que codifica mir-17-92 (más un reportero GFP). El nivel de reducción en la proliferación fue hacia los niveles de fondo de los tumores MB normales: como en aquellos no infectados con el retrovirus. Una vez más, una vía SHH/PTCH aberrante fue necesaria para estas observaciones. [3]
La familia miR-92 son microARN conservados evolutivamente, [14] y tiene un ortólogo en Caenorhabditis elegans , [15] que se ha utilizado ampliamente como organismo modelo en el área de biología del desarrollo. mir-235 , el ortólogo de miR-92 en C. elegans , actúa en la hipodermis y las células gliales para mantener el estado de reposo tanto en neuroblastos como en mesoblastos hasta que el estado nutricional se vuelve favorable, lo que significa que mir-235 acopla los comportamientos de las células madre a la condición nutricional. [16] Además, mir-235 reprime directamente la expresión de nhr-91 , que es un ortólogo del factor nuclear de células germinales de mamíferos ( GCNF ), para mantener las células madre en reposo. [16] La expresión de mir-235 está regulada por la vía de señalización de insulina/factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) (IIS) en respuesta al estado nutricional. Una vez que las condiciones nutricionales se vuelven favorables, la expresión de mir-235 es regulada negativamente por la vía IIS y las células madre salen del estado inactivo y reanudan el programa de desarrollo, como la autorrenovación, la migración y la diferenciación. [16]
En C. elegans , mir-235 es un ortólogo único de la familia miR-92. Sin embargo, mir-235 no forma la estructura de grupo y no está claro si las funciones biológicas se han conservado entre humanos y C. elegans . [15]
A partir de las investigaciones que se han revisado en este artículo, podemos extraer algunas conclusiones sobre cómo el miR-92 podría tener importantes implicaciones clínicas. Gracias al nivel de diversidad en la expresión de miRNA en diferentes tipos de cáncer, su uso como herramienta de diagnóstico y clasificación tiene un gran potencial. La modesta cantidad de miRNA presentes en el genoma y en experimentos de perfilación específicos permiten obtener patrones altamente resueltos sin conjuntos de datos excesivamente complejos. Como ejemplo, se utilizó un conjunto de perfiles de miRNA de cánceres bien diferenciados para entrenar un algoritmo de decisión para su aplicación en otro conjunto de tumores poco diferenciados (para los que el diagnóstico clínico normalmente se establece por medios anatómicos). El éxito del diagnóstico del conjunto de prueba aumentó significativamente. [9]
Aparte del diagnóstico y la caracterización de los cánceres, el descubrimiento de la participación de miR-92 en la fisiología celular esencial y en la promoción del cáncer también tiene valor terapéutico. Volviendo a nuestra revisión del cáncer de mama, la isoforma ERβ1 se ha estudiado en profundidad por sus efectos antiproliferativos y proapoptóticos. [4] Hemos comentado que miR-92 se dirige a ERβ1 y lo regula a la baja, y la evidencia sugiere que miR-92 está regulado por el estrógeno, que se encuentra aguas arriba de ERβ1. [4] La evidencia de esto se demostró mediante el cultivo de células MCF-7 en condiciones de agotamiento de estrógeno y la adición de antagonistas a los receptores de estrógeno: tamoxifeno y E2. miR-92 se reguló al alza en respuesta, lo que sugiere que el papel oncogénico probable de miR-92 en este contexto es la inhibición de la expresión de ERβ1 en presencia de estrógeno. Por lo tanto, una estrategia terapéutica contra el cáncer de mama podría apuntar a reactivar la expresión de ERβ1 a través de la manipulación de la expresión de miR-92. [4]
En el caso de los pacientes con carcinoma hepatocelular (CHC) (descrito en la sección anterior), la PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) demostró una reducción de miR-92a en el plasma en comparación con muestras de sangre sana. [1] De manera similar, la sobreexpresión de miR-92a también se puede detectar en las heces humanas de pacientes con cáncer colorrectal. [17] Esto guarda similitudes con los descubrimientos realizados mediante la elaboración de perfiles de pacientes con leucemia (también analizados en la sección anterior). [6] Las diferencias de expresión en ambos casos se relacionaban con los niveles de miR-638. El miR-638 es un microARN que parece tener una presencia constante en el plasma sanguíneo humano y puede ser fisiológicamente necesario. Esto demuestra que una disminución de la relación miR-92a:miR-638 en el plasma humano puede servir como un valioso marcador diagnóstico no solo para la leucemia sino también para tumores sólidos como el CHC. [6]
Con respecto a los estudios sobre meduloblastoma, la estrategia terapéutica podría incluir el uso de antigomirs contra el grupo oncomir-1 en pacientes que albergan una vía SHH/PATCHED aberrante. [3]