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Microscopía de contraste de interferencia diferencial

Micrasterias furcata fotografiada mediante microscopía DIC transmitida
Daño óptico inducido por láser en LiNbO 3 bajo microscopio Nomarski de 150×

La microscopía de contraste de interferencia diferencial ( DIC ) , también conocida como microscopía de contraste de interferencia de Nomarski ( NIC ) o microscopía Nomarski , es una técnica de microscopía óptica que se utiliza para mejorar el contraste en muestras transparentes y sin teñir . La DIC funciona según el principio de la interferometría para obtener información sobre la longitud del recorrido óptico de la muestra, para ver características invisibles de otro modo. Un sistema óptico relativamente complejo produce una imagen con el objeto que aparece de negro a blanco sobre un fondo gris. Esta imagen es similar a la obtenida mediante microscopía de contraste de fase pero sin el halo de difracción brillante. La técnica fue inventada por Francis Hughes Smith. [1] [ cita requerida ] El "Smith DIK" fue producido por Ernst Leitz Wetzlar en Alemania y era difícil de fabricar. El DIC fue desarrollado más a fondo por el físico polaco Georges Nomarski en 1952. [2]

El DIC funciona separando una fuente de luz polarizada en dos partes ortogonalmente polarizadas y coherentes entre sí, que se desplazan espacialmente (se cortan) en el plano de la muestra y se recombinan antes de la observación. La interferencia de las dos partes en la recombinación es sensible a la diferencia de trayectoria óptica (es decir, el producto del índice de refracción y la longitud de trayectoria geométrica). Al agregar una fase de compensación ajustable que determina la interferencia en una diferencia de trayectoria óptica cero en la muestra, el contraste es proporcional al gradiente de longitud de trayectoria a lo largo de la dirección de corte, lo que da la apariencia de un relieve físico tridimensional que corresponde a la variación de la densidad óptica de la muestra, enfatizando las líneas y los bordes aunque no proporciona una imagen topográficamente precisa.

El camino de la luz

1. La luz no polarizada entra al microscopio y se polariza a 45°.

Se requiere luz polarizada para que la técnica funcione.

2. La luz polarizada entra en el primer prisma de Wollaston modificado por Nomarski y se separa en dos rayos polarizados a 90° entre sí, los rayos de muestreo y de referencia.

Los prismas de Wollaston son un tipo de prisma formado por dos capas de una sustancia cristalina, como el cuarzo, que, debido a la variación del índice de refracción en función de la polarización de la luz, divide la luz según su polarización. El prisma de Nomarski hace que los dos rayos lleguen a un punto focal fuera del cuerpo del prisma, lo que permite una mayor flexibilidad a la hora de configurar el microscopio, ya que el prisma puede enfocarse activamente.

3. El condensador enfoca los dos rayos para que pasen por la muestra. Estos dos rayos se enfocan de modo que pasen por dos puntos adyacentes en la muestra, separados por unos 0,2 μm.

La muestra está iluminada de forma eficaz por dos fuentes de luz coherentes , una con polarización de 0° y la otra con polarización de 90°. Sin embargo, estas dos iluminaciones no están del todo alineadas, ya que una se encuentra ligeramente desplazada respecto de la otra.
La ruta de la luz a través de un microscopio DIC. Los dos haces de luz deben estar paralelos entre el condensador y el objetivo.

4. Los rayos viajan a través de áreas adyacentes de la muestra, separadas por la cizalladura. La separación normalmente es similar a la resolución del microscopio. Experimentarán diferentes longitudes de trayectoria óptica donde las áreas difieren en índice de refracción o espesor. Esto provoca un cambio en la fase de un rayo con respecto al otro debido al retraso experimentado por la onda en el material ópticamente más denso.

El paso de muchos pares de rayos a través de pares de puntos adyacentes en la muestra (y su absorbancia, refracción y dispersión por la muestra) significa que ahora la imagen de la muestra será transportada tanto por la luz polarizada de 0° como por la de 90°. Si se observan individualmente, serían imágenes de campo claro de la muestra, ligeramente desplazadas entre sí. La luz también transporta información sobre la imagen invisible para el ojo humano, la fase de la luz. Esto es vital más adelante. Las diferentes polarizaciones evitan la interferencia entre estas dos imágenes en este punto.

5. Los rayos viajan a través de la lente del objetivo y se enfocan en el segundo prisma Wollaston modificado por Nomarski.

6. El segundo prisma recombina los dos rayos en uno polarizado a 135°. La combinación de los rayos produce interferencias , aclarando u oscureciendo la imagen en ese punto según la diferencia de trayectoria óptica.

Este prisma superpone las dos imágenes de campo claro y alinea sus polarizaciones para que puedan interferir. Sin embargo, las imágenes no se alinean del todo debido al desfase en la iluminación; esto significa que, en lugar de producirse interferencia entre dos rayos de luz que pasan por el mismo punto de la muestra, se produce interferencia entre rayos de luz que pasan por puntos adyacentes que, por tanto, tienen una fase ligeramente diferente. Como la diferencia de fase se debe a la diferencia en la longitud del recorrido óptico, esta recombinación de la luz provoca una " diferenciación óptica " de la longitud del recorrido óptico, lo que genera la imagen que se ve.

Imagen

El proceso de producción de imágenes en un microscopio DIC

La imagen tiene la apariencia de un objeto tridimensional bajo una iluminación muy oblicua, lo que provoca una luz intensa y sombras oscuras en las caras correspondientes. La dirección de la iluminación aparente está definida por la orientación de los prismas de Wollaston.

Como se explicó anteriormente, la imagen se genera a partir de dos imágenes idénticas de campo claro superpuestas con un ligero desfase entre sí (normalmente alrededor de 0,2 μm), y la interferencia posterior debida a la diferencia de fase convierte los cambios de fase (y, por tanto, la longitud del recorrido óptico) en un cambio visible en la oscuridad. Esta interferencia puede ser constructiva o destructiva, dando lugar a la apariencia característica de tres dimensiones.

La diferencia de fase típica que da lugar a la interferencia es muy pequeña, y rara vez supera los 90° (un cuarto de la longitud de onda). Esto se debe a la similitud del índice de refracción de la mayoría de las muestras y el medio en el que se encuentran: por ejemplo, una célula en agua solo tiene una diferencia de índice de refracción de alrededor de 0,05. Esta pequeña diferencia de fase es importante para el correcto funcionamiento del DIC, ya que si la diferencia de fase en la unión entre dos sustancias es demasiado grande, la diferencia de fase podría alcanzar los 180° (la mitad de una longitud de onda), lo que daría lugar a una interferencia destructiva completa y a una región oscura anómala; si la diferencia de fase alcanzara los 360° (una longitud de onda completa), produciría una interferencia constructiva completa, creando una región brillante anómala.

La imagen se puede aproximar (sin tener en cuenta la refracción y la absorción debidas a la muestra y el límite de resolución de la separación del haz) como el diferencial de la longitud del camino óptico con respecto a la posición a lo largo de la muestra a lo largo del corte, y por lo tanto el diferencial del índice de refracción (densidad óptica) de la muestra.

Imágenes DIC con diferentes fases de desplazamiento φ 0

El contraste se puede ajustar utilizando la fase de compensación, ya sea trasladando el prisma Nomarski del objetivo o mediante una placa de onda lambda/4 entre el polarizador y el prisma Normarski del condensador (compensación De-Senarmont). El contraste resultante va desde el campo oscuro para una compensación de fase cero (intensidad proporcional al cuadrado del diferencial de cizallamiento), hasta el relieve típico que se observa para una fase de ~5–90 grados, hasta la tinción óptica a 360 grados, donde la longitud de onda extinguida se desplaza con el diferencial de fase.

Cuando se cotejan imágenes desplazadas secuencialmente, el desplazamiento de fase introducido por el objeto se puede disociar de los artefactos no interferométricos no deseados, lo que generalmente produce una mejora en el contraste, especialmente en muestras turbias. [3]

Aplicaciones

Imágenes específicas de orientación de un cuboide transparente en DIC
Fotorresistencia parcialmente desarrollada en Nomarski DIC

La DIC se utiliza para obtener imágenes de muestras biológicas vivas y sin teñir, como un frotis de un cultivo de tejidos u organismos unicelulares individuales transmitidos por el agua. Debido a la iluminación espacialmente incoherente máxima, la resolución teórica se acerca a la cobertura máxima teórica dictada por la esfera de Ewald . [4] Esto supone una mejora con respecto a los métodos que requieren un mayor grado de coherencia, como el contraste de fase .

El pozo de aleación de aluminio y silicio se hizo visible gracias a Nomarski DIC
Dióxido de silicio parcialmente grabado en Nomarski DIC

Un área no biológica en la que se utiliza la DIC es en el análisis del procesamiento de semiconductores de silicio planares. Las películas delgadas (normalmente de 100 a 1000 nm) en el procesamiento de silicio suelen ser en su mayoría transparentes a la luz visible (por ejemplo, dióxido de silicio, nitruro de silicio y silicio policristalino), y los defectos en ellas o la contaminación que se encuentra sobre ellas se hacen más visibles. Esto también permite determinar si una característica es un hoyo en el material del sustrato o una mancha de material extraño en la parte superior. Las características cristalinas grabadas adquieren una apariencia particularmente llamativa bajo la DIC.

La calidad de la imagen, cuando se utiliza en condiciones adecuadas, es excepcional [ cita requerida ] en cuanto a resolución. Sin embargo, el análisis de imágenes DIC debe tener siempre en cuenta la orientación de los prismas de Wollaston y la dirección aparente de la iluminación, ya que las características paralelas a esta no serán visibles. Sin embargo, esto se supera fácilmente simplemente girando la muestra y observando los cambios en la imagen.

Véase también

Referencias

  1. ^ US2601175A, Hughes, Smith Francis, "Microscopio de interferencia", publicado el 17 de junio de 1952 
  2. ^ Lang, Walter (1968). "Microscopía de contraste de interferencia diferencial de Nomarski" (PDF) . Información de ZEISS . 70 : 114–120 . Consultado el 31 de agosto de 2016 .
  3. ^ Nguyen, TH; Kandel, ME; Rubessa, M.; et al. (2017). "Microscopía de interferencia de luz de gradiente para imágenes 3D de muestras no etiquetadas". Nat Commun . 8 (210): 210. Bibcode :2017NatCo...8..210N. doi :10.1038/s41467-017-00190-7. PMC 5547102 . PMID  28785013. 
  4. ^ Nguyen, TH; Kandel, ME; Rubessa, M.; et al. (2017). "Microscopía de interferencia de luz de gradiente para imágenes 3D de muestras no etiquetadas". Nat Commun . 8 (210): 210. Bibcode :2017NatCo...8..210N. doi :10.1038/s41467-017-00190-7. PMC 5547102 . PMID  28785013. 

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