La edición del genoma fuera del objetivo se refiere a modificaciones genéticas no específicas y no deseadas que pueden surgir mediante el uso de tecnologías de nucleasas diseñadas , tales como: repeticiones palindrómicas cortas agrupadas, regularmente espaciadas ( CRISPR ) - Cas9 , nucleasas efectoras similares a activadoras de la transcripción ( TALEN ), meganucleasas y nucleasas con dedos de zinc (ZFN). [1] Estas herramientas utilizan diferentes mecanismos para unirse a una secuencia predeterminada de ADN (“objetivo”), que escinden (o “cortan”), creando una rotura cromosómica bicatenaria (DSB) que invoca los mecanismos de reparación del ADN de la célula (no -unión de extremos homólogos ( NHEJ ) y recombinación homóloga ( HR )) y conduce a modificaciones específicas del sitio. [2] Si estos complejos no se unen al objetivo, a menudo como resultado de secuencias homólogas y/o tolerancia a errores de coincidencia, escindirán DSB fuera del objetivo y causarán modificaciones genéticas no específicas. [3] [4] [5] Específicamente, los efectos fuera del objetivo consisten en mutaciones puntuales no deseadas , [6] eliminaciones , [7] [8] inserciones , [5] inversiones, [5] y translocaciones . [9] [8]
Los sistemas de nucleasas de diseño, como CRISPR-cas9, se están convirtiendo en herramientas de investigación cada vez más populares debido a su simplicidad, escalabilidad y asequibilidad. [10] [11] Dicho esto, las modificaciones genéticas fuera del objetivo son frecuentes y pueden alterar la función de genes que de otro modo estarían intactos. Múltiples estudios que utilizaron agentes CRISPR-cas9 tempranos encontraron que más del 50% de las mutaciones inducidas por endonucleasas guiadas por ARN no ocurrían en el objetivo. [3] [7] El ARN guía Cas9 (ARNg) reconoce una secuencia de ADN diana de 20 pb, a la que se une y escinde para "editar" la secuencia de ADN. Sin embargo, la unión a la secuencia diana puede tolerar desajustes de hasta varios pares de bases, lo que significa que a menudo hay miles de posibles sitios de unión que presentan varios problemas experimentales y de seguridad. [12] [3] En el ámbito de la investigación, los efectos fuera del objetivo pueden confundir variables en estudios biológicos, lo que lleva a resultados potencialmente engañosos y no reproducibles. [2] En la esfera clínica, las principales preocupaciones giran en torno a la alteración de regiones codificantes vitales que conducen a efectos genotóxicos como el cáncer. [13] En consecuencia, la mejora de la especificidad [14] [15] de las herramientas de edición del genoma y la detección [9] [16] de efectos fuera del objetivo son áreas de investigación que progresan rápidamente. Dicha investigación incorpora el desarrollo y descubrimiento de nucleasas de diseño [17] , [18] programas y bases de datos de predicción computacional, [19] [20] y secuenciación de alto rendimiento [9] [16] para reducir y anticipar la aparición de mutaciones. Muchas herramientas de diseño de nucleasas están todavía en su infancia relativa y, a medida que se comprendan mejor sus propiedades moleculares y comportamientos in vivo , serán cada vez más precisas y predecibles.
El sistema CRISPR-Cas9 funciona como sistema inmunológico adaptativo en bacterias y arqueas. [21] Cuando un virus infecta a la bacteria, este sistema incorpora segmentos del ADN viral en el genoma bacteriano. Tras una segunda invasión, las transcripciones de estas secuencias dirigen una actividad nucleasa a su secuencia complementaria en el virus invasor para destruirlo. [22] [23] [24]
Para extrapolar este método a eucariotas para desarrollar un método de edición de genes, se requieren una proteína Cas9, una secuencia de reconocimiento de ARN y un ARN transactivador. La fusión del ARN CRISPR (ARNcr) con especificidad de secuencia de reconocimiento y el ARN transactivador (ARNtracr) se utiliza comúnmente en experimentos y se denomina ARN guía único (ARNsg). [25] Realiza ambas funciones: los primeros 20 nucleótidos del sgRNA son complementarios a la secuencia objetivo del ADN (función cr), mientras que los nucleótidos siguientes son parte de un motivo adyacente al protoespaciador (PAM; función tracr). [26] [27] [28]
La unión de nucleasas fuera del objetivo se origina a partir de una coincidencia parcial pero suficiente con la secuencia objetivo. Los mecanismos de unión fuera del objetivo se pueden agrupar en dos formas principales: tolerancia al desajuste de bases y desajuste de abultamiento. [29]
Si bien se cree que la especificidad de Cas9 está controlada por el ARNsg de 20 nt y PAM, las mutaciones fuera del objetivo aún prevalecen y podrían ocurrir con desajustes de hasta 3 a 5 pares de bases (de 20) entre el ARNsg y la secuencia de ADN objetivo. [25] [30] Además, las estructuras secundarias de sgRNA también podrían afectar la escisión de los sitios objetivo y no objetivo. Como se mencionó anteriormente, el sgRNA consta de una secuencia (~20 nt) que es complementaria a las secuencias objetivo y va seguida de una secuencia PAM que activa la actividad endonucleasa . Si bien se demostró que 10-12 nt adyacentes a PAM (llamada "secuencia semilla") eran suficientes para la especificidad de Cas9, Wu et al. demostró que en un Cas9 catalíticamente muerto solo se requieren de 1 a 5 pares de bases de secuencia de semilla para la especificidad. [31] Esto también fue demostrado más tarde por otros estudios. La unión a la proteína Cas9 se ve afectada además por varios mecanismos:
Es importante señalar que la metilación del ADN de los sitios CpG reduce la eficacia de la unión de Cas9 y otros factores en las células. Por tanto, existe un vínculo epigenético que se explorará más en el futuro de la edición del epigenoma. [36]
Las variaciones dentro de la secuencia PAM también pueden afectar la actividad del sgRNA, afectando a su vez al propio sgRNA. En los sistemas Cas9 de uso común, el motivo PAM es 5'NGG 3', donde N representa cualquiera de los cuatro nucleótidos del ADN. El requisito de la secuencia PAM puede causar problemas de especificidad ya que algunas regiones tendrán una secuencia diana disponible para realizar una modificación genética deseada. Un informe indicó que el 99,96% de los sitios que antes se suponía que eran objetivos únicos de Cas9 en exones humanos pueden tener posibles efectos fuera del objetivo que contienen NAG o NGG PAM y una falta de coincidencia de una sola base en la secuencia de la semilla. [37]
Tanto los sitios fuera de objetivo con bases faltantes (o eliminaciones) como los sitios fuera de objetivo con bases adicionales (o inserciones) llamados abultamiento de ARN y abultamiento de ADN respectivamente, tienen efectos en la especificidad de Cas9 y la actividad de escisión. Lin et al. Imitó estos abultamientos agregando y eliminando bases de la secuencia de sgRNA de modo que una eliminación de bases en el sgRNA produciría un abultamiento de ARN y una inserción de bases produciría un abultamiento de ADN. [7] Al estudiar las tasas de mutación a través de NHEJ, llegaron a los siguientes resultados:
La nucleasa Cas9 (SpCas9) de Streptococcus pyogenes, ampliamente utilizada , es eficaz; sin embargo, induce mutaciones no deseadas fuera del objetivo a altas frecuencias. Se han descrito varios métodos de ingeniería y detección en un esfuerzo por reducir las mutaciones fuera del objetivo en todo el genoma, incluida la mutación de nucleasa, la modificación de la secuencia del motivo adyacente al protoespaciador (PAM), el truncamiento del ARN guía (ARNg) y el descubrimiento de nuevas nucleasas. [39] Por ejemplo, en 2013, Fu et al. informaron que al truncar el ARNg de <20 pb de longitud a 17 o 18 pb, la especificidad objetivo de la nucleasa aumentaba hasta 5000 veces y rara vez o nunca ocurrían casos de desajustes por encima de 3 bases. [14]
La nucleasa spCas9 también se puede mutar de diversas formas para mejorar la especificidad y el control. Los dominios de nucleasa se pueden mutar independientemente unos de otros en lo que se conoce como nickasas Cas9. Estas nucleasas tienen un dominio de nucleasa activo e inactivo que da como resultado un complejo que realiza la escisión de una sola hebra. [4] Las nickasas Cas9 se pueden emplear en tándem (conocidas como nickasas emparejadas), que realizan dos 'cortes' de una sola hebra en hebras alternas. [4] Al utilizar esta estrategia, ambas nickases Cas9 deben co-localizar, unir y escindir su objetivo, lo que reduce drásticamente la probabilidad de indeles fuera del objetivo . [4] Además, los DSB escindidos por nickasas emparejadas tienen salientes largos en lugar de extremos romos que proporcionan un mejor control de las inserciones específicas.
Como las nucleasas monoméricas a menudo implican altos niveles de efectos no deseados, la dimerización es una estrategia atractiva. En un sistema de dímeros, ambas nucleasas deben unirse a sus objetivos individuales o "medios sitios" y luego interactuar y dimerizarse para iniciar la escisión, lo que disminuye en gran medida la probabilidad de efectos fuera del objetivo. Se ha desarrollado un método que incorpora la confiabilidad de los dominios de nucleasa FokI dependientes de la dimerización, utilizados en ZFN y TALEN, con la simplicidad de CRISPR-cas9. [17] La nucleasa FokI se encontró originalmente en Flavobacterium okeanokoites y solo escindirá el ADN si se activa la dimerización. Básicamente, los investigadores fusionaron esta nucleasa a un complejo CRISPR con una nucleasa Cas9 inactiva (Fok1-dCas9). [17] El ARNg dirige el complejo CRISPR al sitio objetivo, pero el "corte" lo realiza Fok1 dimerizado. Se estima que la estrategia Fok1-dCas9 reduce los efectos detectables fuera del objetivo en 10.000 veces, lo que la hace eficaz para aplicaciones que requieren una edición del genoma específica y muy precisa. [17] [40]
Además de un objetivo de ARNg, Cas9 requiere unirse a una secuencia PAM específica de 2 a 6 nucleótidos. En los sistemas SpCas9 de uso común, el motivo PAM es 5'NGG 3', donde N representa cualquiera de los cuatro nucleótidos de ADN. El requisito de la secuencia PAM puede causar limitaciones de especificidad ya que algunas regiones no tendrán una secuencia diana disponible para realizar una modificación genética deseada. La secuencia PAM se puede editar en motivos NAG y NGA no canónicos que no solo mejoran la especificidad sino que también reducen los efectos fuera del objetivo. [41] Un mutante D1135E parece alterar las especificidades de PAM. El mutante D1135E reduce los efectos no deseados y aumenta la especificidad de SpCas9. [41] Una variante adicional, SpCas9-HF1, también produce mejoras favorables en la especificidad de Cas9. [42] Se han identificado varias combinaciones de sustituciones que se sabe que forman contactos de ADN no específicos (N497A, R661A, Q695A y Q926A). [42] Una sustitución cuádruple de estos residuos (más tarde denominada SpCas9-HF1) tiene niveles extremadamente bajos de efectos fuera del objetivo, según lo detectado por experimentos GUIDE-seq. [42] Variantes como SpCas9-HF1 y D1135E, y otras similares, se pueden combinar, probar y agregar fácilmente a los vectores SpCas9 existentes para reducir las tasas de mutaciones fuera del objetivo. Además, muchas de las estrategias de ingeniería enumeradas anteriormente se pueden combinar para crear herramientas de edición de nucleasas guiadas por ARN cada vez más sólidas y confiables. La evolución dirigida también se puede utilizar para reducir la actividad de la nucleasa en secuencias diana particulares, lo que da lugar a variantes como SpartaCas (que contiene mutaciones D23A, T67L, Y128V y D1251G en relación con SpCas9 de tipo salvaje). [43]
También se han desarrollado la interferencia CRISPR ( CRISPRi ) y la activación CRISPR ( CRISPRa ). [44] Estos sistemas pueden alterar con precisión la transcripción genética a nivel del ADN sin infligir alteraciones genéticas irreversibles. [44] Además, al actuar directamente sobre el ADN, generalmente son más específicos y predecibles en comparación con el ARNi . [45] Aunque CRISPRi/a no puede reemplazar la edición del genoma en todos los experimentos, pueden actuar como alternativas efectivas en algunos casos. CRISPRi y CRISPRa utilizan una enzima Cas9 (dCas9) desactivada que no puede cortar el ADN, pero puede administrar activadores y represores transcripcionales para modular la expresión genética deseada con alta precisión. [44] Actualmente, los efectos fuera del objetivo de CRISPRi son mínimos y muestran una respuesta y sensibilidad reducidas a los desajustes de una sola base. [44] Es importante destacar que cuando ocurren inevitablemente efectos no específicos, son reversibles, dependientes del tiempo y menos dañinos que la edición de ADN, lo que los convierte en alternativas efectivas que pueden limitar la carga fuera del objetivo cuando sea posible. CRISPR-cas13b, utilizando un sistema CRISPR-Cas de tipo IV (a diferencia del tipo II comúnmente utilizado), puede apuntar y editar secuencias de ARN específicas. [46] Una plataforma de edición de ARN de este tipo tiene la capacidad de editar específicamente el ARNm y, por lo tanto, la traducción de proteínas, sin alterar el ADN. Representa una tecnología prometedora que, de tener éxito, reduciría la carga de mutaciones irreversibles fuera del objetivo.
Aunque se pueden tomar medidas cuidadosas para evitar mutaciones fuera del objetivo, e incluso si se logra, es necesario realizar una prueba de confirmación para detectar mutaciones no deseadas. Actualmente existen muchos métodos sesgados e imparciales para dicha detección y sólo dos métodos in vitro . Todos estos se enumeran a continuación:
En el caso de una secuenciación dirigida normal, el enfoque sesgado arrojará resultados sólo para el área de captura prevista, lo que dificulta la búsqueda ya que no aparecerán mutaciones inesperadas en la pantalla. Si bien es fácil y económico, consume mucho tiempo y es costoso una vez que se agregan más sitios de destino. La secuenciación del exoma utiliza la captura del exoma para adquirir las regiones codificantes de proteínas del genoma. Es imparcial, sin embargo, no producirá mutaciones fuera de objetivo en la región no codificante del genoma. En el caso de la secuenciación del genoma completo , se analiza todo el genoma para detectar mutaciones fuera de objetivo. Actualmente, este método es costoso y, al igual que la secuenciación del exoma, el genoma completo también requiere un genoma de referencia para hacer inferencias. [47]
BLESS es la forma más sencilla de detectar y cuantificar mutaciones fuera del objetivo mediante la detección de DSB en el genoma. Este método se basa en el enriquecimiento directo del etiquetado de roturas in situ en estreptavidina. Desarrollado en 2013, [48] BLESS se realiza ligando los extremos DSB con biotina, es decir, biotinilación. A esto le sigue la separación/recogida de dichos extremos ligados usando estreptavidina. Se agrega una secuencia enlazada a las secuencias biotiniladas y luego esta mezcla final se secuencia para producir la posición de la mutación fuera del objetivo. Al ser de naturaleza imparcial, BLESS brinda información sobre el sitio de mutación dentro del genoma en lugar de las proteínas involucradas o asociadas con los DSB. Sin embargo, BLESS sólo puede detectar mutaciones en el momento del experimento y no aquellas que se formaron anteriormente y fueron reparadas. [49]
Mediada por amplificación lineal: la secuenciación de translocación de todo el genoma de alto rendimiento, o LAM-HTGTS, es un método desarrollado para rastrear eventos de translocación causados por la unión entre DSB. [50] Desarrollada para detectar mutaciones fuera del objetivo de TALEN y CRISPR-Cas9, esta técnica se basa en la reparación del ADN mediante la unión de extremos en DSB. Una vez que se agrega la nucleasa, produce mutaciones dentro y fuera del objetivo. Junto a esto hay una secuencia de cebo que también se corta. Por lo tanto, si ocurre otro DSB en un cromosoma distinto del cromosoma de la secuencia del cebo, ambos se unen y se produce una translocación. Dado que se conoce la secuencia del cebo, esta secuencia translocada se amplifica con cebadores. En caso de que no haya translocación, hay un sitio de restricción dentro del cual se escinde para evitar la amplificación únicamente de la secuencia del cebo. Luego, el ADN amplificado se secuencia para estudiar grandes reordenamientos genómicos debido a mutaciones fuera del objetivo. Un inconveniente es que depende de la presencia simultánea de un cebo y otro DSB.
Otro enfoque para encontrar mutaciones fuera del objetivo debido a la actividad de la nucleasa es el método GUIDE-Seq . GUIDE-seq o identificación imparcial de DSB en todo el genoma habilitada por secuenciación se basa en la incorporación de oligodesoxinucleótidos bicatenarios (dsODN) en DSB a través de NHEJ. Su amplificación va seguida de la secuenciación. Dado que se utilizarán dos cebadores para secuenciar los dsODN, se amplificarán las regiones que flanquean el DSB junto con el DSB. Permitiendo así mapear la mutación fuera del objetivo. Esta técnica se ha aplicado para identificar todos los sitios fuera del objetivo conocidos anteriormente, así como otros nuevos con frecuencias tan bajas como 0,03%. Sin embargo, al igual que BLESS, GUIDE-seq solo puede detectar DSB presentes en el momento del estudio.
Uno de los métodos in vitro actuales , Digenome-Seq, utiliza la propiedad de Cas9 de escindir el genoma para obtener un perfil imparcial de todo el genoma. En este método, se agrega Cas9 al ADNg y los efectos posteriores se estudian mediante secuenciación de alto rendimiento. Dado que los fragmentos se forman debido a la misma nucleasa, los extremos de estos fragmentos se pueden mapear alineados. Dos grandes ventajas son que se puede utilizar para estudiar hasta 10 gRNA a la vez y puede identificar objetivos con frecuencias tan bajas como el 0,01%. [9] Sin embargo, la principal ventaja es que este método es in vitro , es decir, los DSB introducidos por Cas9 no serán procesados por la maquinaria de reparación del ADN (a diferencia de BLESS y GUIDE-seq) y, por lo tanto, incluirán todos los posibles mutantes fuera del objetivo. Sin embargo, también podría dar lugar a una gran cantidad de falsos positivos. [51]
La última incorporación a los métodos in vitro para detectar mutaciones fuera del objetivo es CIRCLE-seq. Con licencia de Beacon genomics (junto con GUIDE-seq), [52] CIRCLE-seq tiene como objetivo eliminar los inconvenientes de Digenome-seq, como la necesidad de un tamaño de muestra grande y una profundidad de lectura (~400 millones de lecturas) y el alto fondo que dificulta la identificación de eventos de escisión de baja frecuencia. [53] Adopta una estrategia independiente de la enzima de restricción para crear y seleccionar la conversión de ADN cortado aleatoriamente. Durante la escisión, el ADN objetivo forma un bucle de tallo al que se pueden agregar adaptadores para la secuenciación. Si bien esto resultó posible, la otra posibilidad produjo una diferencia mucho mayor en la detección. En el segundo caso, la secuencia se escinde usando Cas9 y cuando se escinde nuevamente en la mitad del sitio, queda disponible un corte circular (de ahí el nombre CIRCLE-seq). Casi todos los sitios identificados mediante circularización contienen sitios detectados linealmente y otros más nuevos, lo que sugiere que CIRCLE-seq no sesga entre rupturas y también obtiene fuertes rupturas de baja frecuencia. Además, ayuda a secuenciar el sitio de rotura desde ambos lados de la escisión en comparación con otros métodos que tienen solo un lado de lectura.
Las nucleasas como Cas9 también pueden ser desafiadas in vitro mediante bibliotecas aleatorias de objetivos. [54] La ligadura del adaptador para cuantificar los miembros de la biblioteca escindidos y no escindidos permite una medición imparcial del perfil de especificidad de una nucleasa. La medición de la escisión de bibliotecas de objetivos con códigos de barras (BLT) con SpCas9 indicó que los perfiles de especificidad eran específicos de la guía y dependían de la secuencia guía, así como de la propia nucleasa. Luego se pueden utilizar perfiles de especificidad imparciales basados en cada complejo Cas9-ARNg particular para construir modelos predictivos específicos de guías para la escisión in vitro .
Para que las tecnologías de edición genética den el salto hacia un uso seguro y generalizado en la clínica, la tasa de modificación fuera del objetivo debe volverse obsoleta. La seguridad del tratamiento con terapia génica es motivo de gran preocupación, especialmente durante los ensayos clínicos, cuando modificaciones fuera del objetivo pueden bloquear el desarrollo posterior de un producto candidato. [55] Quizás el ejemplo más conocido de terapia génica moderna es la terapia CAR-T, que se utiliza para el tratamiento del linfoma de células B. Para limitar la tasa de escisión fuera del objetivo, la terapia utiliza un TALEN altamente específico y finamente ajustado, que ha demostrado tener poca o ninguna interacción de fondo fuera del objetivo. [55] La inmunoterapia CAR-T es un procedimiento ex vivo , lo que significa que las células inmunes del paciente (en este caso, células T ) se extraen y editan utilizando nucleasas de diseño. [55] Si bien el desarrollo del sistema TALEN es costoso y requiere mucho tiempo, las modificaciones de investigación e ingeniería han limitado drásticamente su tasa de interacción fuera del objetivo. Sin embargo, los pacientes que reciben el tratamiento todavía son monitoreados con frecuencia y lo serán durante los próximos 15 años para que los efectos no deseados y las respuestas inmunogénicas puedan analizarse y tomarse en consideración a medida que se lleven a ensayo clínicas nuevas terapias genéticas. [56]
Un ensayo clínico de fase I/II reclutó a 12 pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) para probar la seguridad y eficacia de la administración de células T auxiliares autólogas modificadas con ZFN. [57] A través de eliminaciones dirigidas, el ZFN personalizado desactiva el gen del receptor de quimiocina CC 5 ( CCR5 ), que codifica un correceptor que utiliza el virus del VIH para ingresar a la célula. [58] Como resultado del alto grado de homología de secuencia entre los receptores de quimiocinas CC, esta ZFN también escinde CCR2 , lo que provoca deleciones y reordenamientos genómicos fuera del objetivo de ~15 kb. [58] [59] Los impactos de estas modificaciones de CCR2 aún no se conocen y hasta la fecha no se han informado efectos secundarios. Sin embargo, se sabe que CCR2 desempeña muchas funciones críticas en los sistemas neuronal y metabólico. [60] [61]
Actualmente se están probando impulsores genéticos diseñados utilizando CRISPR-cas9 y se han propuesto como estrategias para eliminar especies invasoras y vectores de enfermedades. Al modificar genéticamente un organismo para que exprese una endonucleasa endógena específica de secuencia, se puede escindir un objetivo (como un gen de fertilidad) en el cromosoma opuesto. [62] Un DSB en el objetivo conduce a una reparación homóloga que efectivamente hace que el organismo sea homocigótico para la secuencia objetivo deseada. Esta estrategia, conocida como impulso de búsqueda, puede suprimir una población al afectar un gen crítico o inducir esterilidad recesiva. Sin embargo, si dicho sistema se liberara, el sistema CRISPR-cas9 seguiría funcionando indefinidamente. Con cada generación subsiguiente, las mutaciones fuera del objetivo serían cada vez más probables y los efectos de estas mutaciones en una especie serían estocásticos. Las mutaciones fuera del objetivo podrían desactivar las cualidades supresoras de un impulso genético mientras se mantiene la expresión de la endonucleasa. En tal situación, habría un mayor riesgo de flujo de genes entre la especie objetivo y otras especies que probablemente conduzcan a resultados no deseados. [63]
El mayor uso de la edición del genoma y su eventual traducción hacia el uso clínico ha suscitado controversia en torno a la verdadera carga de las tecnologías fuera del objetivo.
El 30 de mayo de 2017, se publicó un artículo por correspondencia de dos páginas en Nature Methods que informaba de un número inusualmente alto de SNV e indeles fuera del objetivo después de secuenciar ratones que previamente participaron en un experimento de reparación de genes in vivo . [64] El experimento anterior, completado por el mismo grupo, restauró con éxito la visión de la cepa de ratón ciego ( rd1 ) corrigiendo la mutación Y347X en el gen Pde6b utilizando un sistema CRISPR-cas9. [65] Después de completar el experimento, se secuenció el genoma completo de dos ratones corregidos genéticamente y se compararon con los genomas de cepas de ratón conocidas y de control. Se descubrieron más de 1.600 SNV y 128 indeles, de los cuales 1.397 SNV y 117 indeles se compartieron entre los dos ratones editados, lo que sugiere que los efectos fuera del objetivo no fueron aleatorios. Los algoritmos que intentaban predecir la ubicación de estas mutaciones fuera del objetivo fallaron en una abrumadora mayoría de loci. En comparación, un estudio de secuenciación del exoma completo de 2016 encontró 19 SNV y 3 indeles en 5 ratones editados, mientras que Schaefer et al. encontraron 115 SNV exónicos y 9 indeles en solo 2 ratones editados. [66] Muchos expertos no estuvieron de acuerdo con el artículo y lo criticaron a través de artículos de revistas [66] y redes sociales, sugiriendo que en el artículo inicial se utilizaron tratamientos CRISPR inusuales y que el tamaño de la muestra era demasiado bajo para ser significativo (n = 2). Nature Methods ha publicado dos notas editoriales sobre el artículo. [67] No obstante, se ha descubierto sistemáticamente que las tasas fuera del objetivo son más frecuentes in vivo en comparación con los experimentos de cultivo celular, y se cree que son particularmente comunes en humanos. [3] [7]
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