G418 ( geneticina ) es un antibiótico aminoglucósido similar en estructura a la gentamicina B1 . Es producido por Micromonospora rhodorangea . [1] G418 bloquea la síntesis de polipéptidos al inhibir el paso de elongación tanto en células procariotas como eucariotas . [1] La resistencia a G418 es conferida por el gen neo de Tn5 que codifica una aminoglucósido 3'-fosfotransferasa, APT 3' II. [1] G418 es un análogo del sulfato de neomicina y tiene un mecanismo similar a la neomicina . G418 se usa comúnmente en la investigación de laboratorio para seleccionar células genéticamente modificadas. [2] En general, para bacterias y algas se utilizan concentraciones de 5 μg/mL o menos, para células de mamíferos se utilizan concentraciones de aproximadamente 400 μg/mL para la selección y 200 μg/mL para el mantenimiento. Sin embargo, la concentración óptima para la selección de clones resistentes en células de mamíferos depende de la línea celular utilizada, así como del plásmido que porta el gen de resistencia, por lo que se debe realizar una titulación de antibióticos para encontrar la mejor condición para cada sistema experimental. La titulación debe realizarse utilizando concentraciones de antibióticos que van desde 100 μg/mL hasta 1400 μg/mL. La selección de clones resistentes puede requerir de 1 a 3 semanas. [ cita requerida ]
El G418 se produce mediante procesos de fermentación y aislamiento, y la cepa productora de G418, Micromonospora rhodorangea, produce muchas otras gentamicinas mientras produce G418. Las impurezas comunes de G418 incluyen las gentamicinas A, C1, C1a, C2, C2a y X2. [3] La calidad de G418 no se basa solo en la potencia, sino más bien en la selectividad definida por la curva de eliminación de las células sensibles frente a las resistentes. Un buen producto G418 tiene la LD 50 más baja para las células sensibles (como NIH 3T3 ) y la LD 50 más alta (puede ser de hasta 5000 μg/ml) para las células resistentes (NIH 3T3 transfectadas con genes resistentes). Las gentamicinas casi no tienen selectividad, excepto la gentamicina X2. [4]
El G418 se utiliza rutinariamente como agente selectivo en cultivos celulares. Los investigadores pueden vincular el gen de resistencia selectiva neoR con su vector. Luego, si el vector se introduce con éxito en las células, estas pueden convertirse en células resistentes al G418. Después del tratamiento con G418, estas células vector(-) morirán, mientras que las células vector(+) sobrevivirán. Este método puede ayudar a los investigadores a seleccionar células vector(+). [1] [5]
El disulfato de G418 y otros aminoglucósidos impiden la síntesis de proteínas en las primeras etapas de elongación, postiniciación e iniciación de la traducción. La resistencia al disulfato de G418 es conferida por el gen de resistencia a la neomicina ( neo) de los transposones Tn5 o Tn601 (903). Las células transfectadas con plásmidos de resistencia que contienen el gen neo pueden expresar la aminoglucósido 3'-fosfotransferasa (APT 3' I o APT 3' II) que modifica covalentemente el G418 a G418 3-fosfórico, que tiene una potencia insignificante y una baja afinidad por los ribosomas procariotas y eucariotas. [6]