En biología molecular , una biblioteca es una colección de fragmentos de material genético que se almacenan y propagan en una población de microbios a través del proceso de clonación molecular . Existen diferentes tipos de bibliotecas de ADN, incluidas las bibliotecas de ADNc (formadas a partir de ARN transcrito de forma inversa ), bibliotecas genómicas (formadas a partir de ADN genómico) y bibliotecas de mutantes aleatorios (formadas por síntesis de genes de novo donde se incorporan nucleótidos o codones alternativos). La tecnología de bibliotecas de ADN es un pilar de la biología molecular actual , la ingeniería genética y la ingeniería de proteínas , y las aplicaciones de estas bibliotecas dependen de la fuente de los fragmentos de ADN originales. Existen diferencias en los vectores de clonación y las técnicas utilizadas en la preparación de la biblioteca, pero en general cada fragmento de ADN se inserta de forma única en un vector de clonación y el grupo de moléculas de ADN recombinante se transfiere luego a una población de bacterias (una biblioteca de cromosomas artificiales bacterianos o BAC) o levadura de modo que cada organismo contenga en promedio un constructo (vector + inserto). A medida que la población de organismos crece en un cultivo, las moléculas de ADN que contienen se copian y propagan (es decir, se "clonan").
El término "biblioteca" puede referirse a una población de organismos, cada uno de los cuales lleva una molécula de ADN insertada en un vector de clonación, o alternativamente a la colección de todas las moléculas del vector clonado.
Una biblioteca de ADNc representa una muestra del ARNm purificado de una fuente particular (ya sea una colección de células, un tejido particular o un organismo entero), que se ha convertido nuevamente en una plantilla de ADN mediante el uso de la enzima transcriptasa inversa . Por lo tanto, representa los genes que se estaban transcribiendo activamente en esa fuente particular en las condiciones fisiológicas, de desarrollo o ambientales que existían cuando se purificó el ARNm. Las bibliotecas de ADNc se pueden generar utilizando técnicas que promueven clones de "longitud completa" o en condiciones que generan fragmentos más cortos utilizados para la identificación de " etiquetas de secuencia expresadas ".
Las bibliotecas de ADNc son útiles en la genética inversa, pero sólo representan una porción muy pequeña (menos del 1%) del genoma total de un organismo determinado.
Las aplicaciones de las bibliotecas de ADNc incluyen:
Una biblioteca genómica es un conjunto de clones que juntos representan el genoma completo de un organismo determinado. La cantidad de clones que constituyen una biblioteca genómica depende de (1) el tamaño del genoma en cuestión y (2) el tamaño del inserto tolerado por el sistema de vector de clonación en particular . Para la mayoría de los propósitos prácticos, la fuente de tejido del ADN genómico no es importante porque cada célula del cuerpo contiene ADN prácticamente idéntico (con algunas excepciones).
Las aplicaciones de las bibliotecas genómicas incluyen:
A diferencia de los tipos de bibliotecas descritos anteriormente, existe una variedad de métodos artificiales para crear bibliotecas de genes variantes. [1] La variación en todo el gen se puede introducir aleatoriamente mediante PCR propensa a errores , [2] mezcla de ADN para recombinar partes de genes similares, [3] o métodos basados en transposones para introducir indels . [4] Alternativamente, las mutaciones se pueden dirigir a codones específicos durante la síntesis de novo o mutagénesis de saturación para construir uno o más mutantes puntuales de un gen de forma controlada. [5] Esto da como resultado una mezcla de moléculas de ADN bicatenario que representan variantes del gen original.
Las proteínas expresadas en estas bibliotecas pueden entonces analizarse para detectar variantes que presenten propiedades favorables (por ejemplo, estabilidad, afinidad de unión o actividad enzimática). Esto puede repetirse en ciclos de creación de variantes genéticas y análisis de los productos de expresión en un proceso de evolución dirigida . [1]
Si se crea una biblioteca de ARNm (es decir, con clones de ADNc), existen varios protocolos posibles para aislar el ARNm de longitud completa. Para extraer ADN para bibliotecas de ADN genómico (también conocido como ADNg), puede resultar útil una minipreparación de ADN.
Las bibliotecas de ADNc requieren un cuidado especial para garantizar que los clones completos de ARNm se capturen como ADNc (que luego se insertarán en vectores). Se han diseñado varios protocolos para optimizar la síntesis de la primera y la segunda cadena de ADNc por este motivo, y también para hacer más probable la clonación direccional en el vector.
Los fragmentos de ADNg se generan a partir del ADNg extraído mediante enzimas de restricción de corte frecuente no específicas.
Las secuencias de nucleótidos de interés se conservan como inserciones en un plásmido o en el genoma de un bacteriófago que se ha utilizado para infectar células bacterianas.
Los vectores se propagan más comúnmente en células bacterianas, pero si se utiliza un YAC (cromosoma artificial de levadura), se pueden utilizar células de levadura. Los vectores también se pueden propagar en virus, pero esto puede llevar mucho tiempo y ser tedioso. Sin embargo, la alta eficiencia de transfección lograda mediante el uso de virus (a menudo fagos) los hace útiles para empaquetar el vector (con el inserto ligado) y luego introducirlo en la célula bacteriana (o de levadura).
Además, para las bibliotecas de ADNc, se ha desarrollado un sistema que utiliza el fago Lambda Zap II, ExAssist y dos especies de E. coli. También se puede utilizar en su lugar un sistema Cre-Lox que utiliza sitios loxP y la expresión in vivo de la enzima recombinasa. Estos son ejemplos de sistemas de escisión in vivo. La escisión in vitro implica la subclonación, a menudo utilizando enzimas de restricción y estrategias de clonación tradicionales. La escisión in vitro puede requerir más tiempo y más trabajo "práctico" que los sistemas de escisión in vivo. En cualquier caso, los sistemas permiten el movimiento del vector desde el fago a una célula viva, donde el vector puede replicarse y propagarse hasta que se vaya a utilizar la biblioteca.
Esto implica "seleccionar" las secuencias de interés. Existen múltiples métodos posibles para lograrlo.