La secuenciación masiva de firmas paralelas ( MPSS ) es un procedimiento que se utiliza para identificar y cuantificar transcripciones de ARNm , lo que da como resultado datos similares al análisis en serie de la expresión génica (SAGE), aunque emplea una serie de pasos bioquímicos y de secuenciación que son sustancialmente diferentes.
MPSS es un método para determinar los niveles de expresión de ARNm contando el número de moléculas de ARNm individuales producidas por cada gen. Es "abierto" en el sentido de que la identidad de los ARN que se van a medir no está predeterminada como ocurre con los microarrays de expresión genética .
Primero se convierte una muestra de ARNm en ADN complementario ( ADNc ) mediante transcriptasa inversa , lo que facilita las manipulaciones posteriores. Estos ADNc se fusionan a una pequeña "etiqueta" de oligonucleótido que permite amplificar el ADNc por PCR y luego acoplarlo a microperlas. Después de varias rondas de determinación de la secuencia, mediante la hibridación de sondas marcadas con fluorescencia, se determina una firma de secuencia de aproximadamente 16 a 20 pb de cada perla. Las imágenes fluorescentes capturan la señal de todas las perlas, mientras están fijadas a una superficie bidimensional, por lo que las secuencias de ADN se determinan a partir de todas las perlas en paralelo. Hay cierta amplificación del material de partida por lo que, al final, se obtienen aproximadamente 1.000.000 de lecturas de secuencia por experimento. [1]
MPSS permite identificar las transcripciones de ARNm mediante la generación de una secuencia distintiva de 17 a 20 pb ( par de bases ) adyacente al extremo 3' del sitio más 3' de la enzima de restricción designada (comúnmente Sau3A o DpnII ). Cada secuencia característica se clona en una entre un millón de microperlas . La técnica garantiza que solo haya un tipo de secuencia de ADN en una microperla. Entonces, si hay 50 copias de una transcripción específica en la muestra biológica, estas transcripciones se capturarán en 50 microperlas diferentes, cada una de las cuales contendrá aproximadamente 100.000 copias amplificadas de la secuencia distintiva específica. Luego, las microperlas se disponen en una celda de flujo para su secuenciación y cuantificación. Las firmas de secuencia se descifran mediante la identificación paralela de cuatro bases mediante hibridación con codificadores marcados con fluorescencia (Figura 5). Cada uno de los codificadores tiene una etiqueta única que se detecta después de la hibridación tomando una imagen de la matriz de microperlas. El siguiente paso es escindir y eliminar ese conjunto de cuatro bases y revelar las siguientes cuatro bases para una nueva ronda de hibridación con codificadores y adquisición de imágenes. El resultado bruto es una lista de secuencias distintivas de 17 a 20 pb, que se pueden anotar en el genoma humano para la identificación de genes.
La secuencia de etiqueta más larga confiere una mayor especificidad que la etiqueta SAGE clásica de 9 a 10 pb . El nivel de expresión genética única está representado por el recuento de transcripciones presentes por millón de moléculas, similar a la producción de SAGE. Una ventaja significativa es el mayor tamaño de la biblioteca en comparación con SAGE. Una biblioteca MPSS suele contener 1 millón de etiquetas de firma, que es aproximadamente 20 veces el tamaño de una biblioteca SAGE. Algunas de las desventajas relacionadas con SAGE también se aplican a MPSS, como la pérdida de ciertas transcripciones debido a la falta de un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción y la ambigüedad en la anotación de etiquetas. La alta sensibilidad y la expresión genética absoluta ciertamente favorecen el MPSS. Sin embargo, la tecnología sólo está disponible a través de Lynxgen Therapeutics, Inc. (luego Solexa Inc hasta 2006 y luego Illumina ).