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RoGFP

La proteína fluorescente verde sensible a la reducción-oxidación ( roGFP ) es una proteína fluorescente verde diseñada para ser sensible a los cambios en el entorno redox local . Las roGFP se utilizan como biosensores sensibles a la reducción-oxidación .

En 2004, los investigadores del laboratorio de S. James Remington en la Universidad de Oregón construyeron las primeras roGFP introduciendo dos cisteínas en la estructura de barril beta de la GFP. La proteína diseñada resultante podría existir en dos estados de oxidación diferentes ( ditiol reducido o disulfuro oxidado ), cada uno con diferentes propiedades fluorescentes . [2]

Originalmente, los miembros del laboratorio de Remington publicaron seis versiones de roGFP, denominadas roGFP1-6 (ver más detalles estructurales a continuación). Diferentes grupos de investigadores introdujeron cisteínas en diferentes lugares de la molécula de GFP y, en general, descubrieron que las cisteínas introducidas en las posiciones de los aminoácidos 147 y 204 producían los resultados más sólidos. [3]

Las roGFP suelen estar codificadas genéticamente en las células para la obtención de imágenes in vivo del potencial redox. En las células, las roGFP pueden modificarse generalmente mediante enzimas redox como la glutaredoxina o la tiorredoxina . La roGFP2 interactúa preferentemente con las glutaredoxinas y, por lo tanto, informa sobre el potencial redox del glutatión celular . [4]

Se han realizado varios intentos para crear roGFP que sean más fáciles de obtener imágenes de células vivas. En particular, la sustitución de tres aminoácidos con carga positiva adyacentes al disulfuro en roGFP1 mejora drásticamente la tasa de respuesta de los roGFP a los cambios fisiológicamente relevantes en el potencial redox. Las variantes de roGFP resultantes, denominadas roGFP1-R1 a roGFP1-R14, son mucho más adecuadas para la obtención de imágenes de células vivas. [1] La variante roGFP1-R12 se ha utilizado para monitorear el potencial redox en bacterias y levaduras, [5] [6] pero también para estudios del potencial redox organizado espacialmente en organismos multicelulares vivos como el nematodo modelo C. elegans . [7] Además, los roGFP se utilizan para investigar la topología de las proteínas del RE o para analizar la capacidad de producción de ROS de los productos químicos . [8] [9]

Una mejora notable de los roGFP se produjo en 2008, cuando se aumentó aún más la especificidad de roGFP2 para el glutatión al vincularlo con la glutaredoxina humana 1 (Grx1). [10] Al expresar los sensores de fusión Grx1-roGFP en el organismo de interés y/o dirigir la proteína a un compartimento celular, es posible medir el potencial redox del glutatión en un compartimento celular específico en tiempo real y, por lo tanto, proporciona ventajas importantes en comparación con otros métodos estáticos invasivos, por ejemplo, HPLC .

Dada la variedad de roGFP, se han hecho algunos esfuerzos para evaluar su rendimiento. Por ejemplo, los miembros del grupo de Javier Apfeld publicaron un método en 2020 que describe los "rangos adecuados" de diferentes roGFP, determinados por la sensibilidad de cada sensor al ruido experimental en diferentes condiciones redox. [11]

Especies de roGFP

Consulte Kostyulk 2020 [12] para una revisión más completa de los diferentes sensores redox.

Véase también

Referencias

  1. ^ abc Cannon MB, Remington SJ (enero de 2006). "Reingeniería de proteína fluorescente verde sensible a la oxidación-reducción para mejorar la tasa de respuesta". Protein Science . 15 (1): 45–57. doi :10.1110/ps.051734306. PMC  2242357 . PMID  16322566.
  2. ^ ab Hanson GT, Aggeler R, Oglesbee D, Cannon M, Capaldi RA, Tsien RY, Remington SJ (marzo de 2004). "Investigación del potencial redox mitocondrial con indicadores de proteína fluorescente verde sensibles al redox". The Journal of Biological Chemistry . 279 (13): 13044–53. doi : 10.1074/jbc.M312846200 . PMID  14722062.
  3. ^ Schwarzländer M, Fricker MD, Müller C, Marty L, Brach T, Novak J, et al. (agosto de 2008). "Imágenes confocales del potencial redox del glutatión en células vegetales vivas". Journal of Microscopy . 231 (2): 299–316. doi :10.1111/j.1365-2818.2008.02030.x. PMID  18778428. S2CID  28455264.
  4. ^ Meyer AJ, Brach T, Marty L, Kreye S, Rouhier N, Jacquot JP, Hell R (diciembre de 2007). "La GFP sensible a la oxidación-reducción en Arabidopsis thaliana es un biosensor cuantitativo para el potencial redox del tampón redox de glutatión celular". The Plant Journal . 52 (5): 973–86. doi : 10.1111/j.1365-313X.2007.03280.x . PMID  17892447.
  5. ^ Liu J, Wang Z, Kandasamy V, Lee SY, Solem C, Jensen PR (noviembre de 2017). "Aprovechamiento de la maquinaria respiratoria para la producción de alto rendimiento de sustancias químicas en Lactococcus lactis metabólicamente modificado" (PDF) . Ingeniería metabólica . 44 : 22–29. doi :10.1016/j.ymben.2017.09.001. PMID  28890188. S2CID  23405962.
  6. ^ Yu S, Qin W, Zhuang G, Zhang X, Chen G, Liu W (mayo de 2009). "Monitoreo del estrés oxidativo y el daño del ADN inducido por metales pesados ​​en levaduras que expresan una proteína fluorescente verde sensible a la oxidación". Current Microbiology . 58 (5): 504–10. doi :10.1007/s00284-008-9354-y. PMID  19184609.
  7. ^ Romero-Aristizabal C, Marks DS, Fontana W, Apfeld J (septiembre de 2014). "Organización espacial regulada y sensibilidad de la oxidación proteica citosólica en Caenorhabditis elegans". Nature Communications . 5 (1): 5020. Bibcode :2014NatCo...5.5020R. doi :10.1038/ncomms6020. PMC 4181376 . PMID  25262602. 
  8. ^ Brach T, Soyk S, Müller C, Hinz G, Hell R, Brandizzi F, Meyer AJ (febrero de 2009). "Análisis topológico no invasivo de proteínas de membrana en la vía secretora". The Plant Journal . 57 (3): 534–41. doi :10.1111/j.1365-313X.2008.03704.x. PMID  18939964.
  9. ^ Schwarzländer M, Fricker MD, Sweetlove LJ (mayo de 2009). "Monitoreo del estado redox in vivo de las mitocondrias de las plantas: efecto de los inhibidores respiratorios, estrés abiótico y evaluación de la recuperación del desafío oxidativo". Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics . 1787 (5): 468–75. doi :10.1016/j.bbabio.2009.01.020. PMID  19366606.
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  11. ^ Stanley JA, Johnsen SB, Apfeld J (octubre de 2020). "SensorOverlord predice la precisión de las mediciones con biosensores ratiométricos". Scientific Reports . 10 (1): 16843. Bibcode :2020NatSR..1016843S. doi :10.1038/s41598-020-73987-0. PMC 7544824 . PMID  33033364. 
  12. ^ Kostyuk AI, Panova AS, Kokova AD, Kotova DA, Maltsev DI, Podgorny OV, et al. (octubre de 2020). "Imágenes in vivo con biosensores redox codificados genéticamente". Revista internacional de ciencias moleculares . 21 (21): 8164. doi : 10.3390/ijms21218164 . PMC 7662651 . PMID  33142884. 
  13. ^ Lohman JR, Remington SJ (agosto de 2008). "Desarrollo de una familia de indicadores proteicos fluorescentes verdes sensibles a la oxidación-reducción para su uso en entornos subcelulares relativamente oxidantes". Bioquímica . 47 (33): 8678–88. doi :10.1021/bi800498g. PMID  18652491.
  14. ^ Bhaskar A, Chawla M, Mehta M, Parikh P, Chandra P, Bhave D, et al. (enero de 2014). "Reingeniería de GFP sensible a la oxidación-reducción para medir el potencial de oxidación-reducción de micotiol de Mycobacterium tuberculosis durante la infección". PLOS Pathogens . 10 (1). Christopher M. Sassetti (ed.): e1003902. doi : 10.1371/journal.ppat.1003902 . PMC 3907381 . PMID  24497832. 
  15. ^ Loi VV, Harms M, Müller M, Huyen NT, Hamilton CJ, Hochgräfe F, et al. (mayo de 2017). "Imágenes en tiempo real del potencial redox del bacillitiol en el patógeno humano Staphylococcus aureus utilizando un biosensor redox fusionado con bacilliredoxina codificado genéticamente". Antioxidantes y señalización redox . 26 (15): 835–848. doi :10.1089/ars.2016.6733. PMC 5444506 . PMID  27462976. 
  16. ^ Ebersoll S, Bogacz M, Günter LM, Dick TP, Krauth-Siegel RL (enero de 2020). "Un biosensor acoplado a triparredoxina revela un metabolismo mitocondrial de tripanotiona en tripanosomas". eLife . 9 : –53227. doi : 10.7554/eLife.53227 . PMC 7046469 . PMID  32003744. 
  17. ^ Gutscher M, Sobotta MC, Wabnitz GH, Ballikaya S, Meyer AJ, Samstag Y, Dick TP (noviembre de 2009). "Oxidación de tiol de proteína basada en proximidad por peroxidasas que eliminan H2O2". The Journal of Biological Chemistry . 284 (46): 31532–40. doi : 10.1074/jbc.M109.059246 . PMC 2797222 . PMID  19755417. 
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