La orientación axonal (también llamada búsqueda de rutas axonal ) es un subcampo del desarrollo neuronal que se ocupa del proceso por el cual las neuronas envían axones para alcanzar sus objetivos correctos. Los axones suelen seguir rutas muy precisas en el sistema nervioso, y la forma en que logran encontrar su camino con tanta precisión es un área de investigación en curso.
El crecimiento del axón se produce a partir de una región denominada cono de crecimiento y la llegada al objetivo del axón se logra con relativamente pocas moléculas de guía. Los receptores del cono de crecimiento responden a las señales de guía.
Los axones en crecimiento tienen una estructura altamente móvil en la punta de crecimiento llamada cono de crecimiento , que responde a señales en el entorno extracelular que le indican al axón en qué dirección crecer. Estas señales, llamadas señales de orientación, pueden ser fijas en un lugar o difusibles; pueden atraer o repeler axones. Los conos de crecimiento contienen receptores que reconocen estas señales de orientación e interpretan la señal en una respuesta quimiotrópica . El marco teórico general es que cuando un cono de crecimiento "detecta" una señal de orientación, los receptores activan varias moléculas de señalización en el cono de crecimiento que eventualmente afectan al citoesqueleto . Si el cono de crecimiento detecta un gradiente de señal de orientación, la señalización intracelular en el cono de crecimiento ocurre de manera asimétrica, de modo que los cambios del citoesqueleto ocurren asimétricamente y el cono de crecimiento gira hacia o desde la señal de orientación. [1]
Una combinación de métodos genéticos y bioquímicos (ver más abajo) ha llevado al descubrimiento de varias clases importantes de moléculas de guía axonal y sus receptores: [2]
Además, los conos de crecimiento utilizan muchas otras clases de moléculas extracelulares para navegar adecuadamente:
Los axones en crecimiento dependen de una variedad de señales de orientación para decidir la vía de crecimiento. Los conos de crecimiento de los axones en expansión procesan estas señales en un intrincado sistema de interpretación e integración de señales, con el fin de garantizar una orientación adecuada. [3] Estas señales se pueden subdividir funcionalmente en:
Dada la abundancia de estas diferentes señales de orientación, anteriormente se creía que los conos de crecimiento integraban información variada simplemente sumando el gradiente de señales, en diferentes valencias, en un punto dado en el tiempo, para tomar una decisión sobre la dirección del crecimiento. Sin embargo, estudios en sistemas nerviosos de vertebrados de axones que cruzan la línea media ventral han demostrado que las señales moduladoras juegan un papel crucial en la sintonización de las respuestas de los axones a otras señales, lo que sugiere que el proceso de guía de los axones no es lineal. Por ejemplo, los axones comisurales son atraídos por Netrin y repelidos por Slit. Sin embargo, a medida que los axones se acercan a la línea media, la acción repelente de Slit es suprimida por el receptor Robo-3/Rig-1. [4] Una vez que los axones cruzan la línea media, la activación de Robo por Slit silencia la atracción mediada por Netrin, y los axones son repelidos por Slit.
La formación de un tracto nervioso sigue varias reglas básicas. En los sistemas nerviosos de los invertebrados y de los vertebrados, los tractos nerviosos iniciales están formados por los axones pioneros de las neuronas pioneras . [5] Estos axones siguen una vía reproducible, se detienen en objetivos intermedios y se ramifican en ciertos puntos de elección, en el proceso de dirigirse a su destino final. Este principio se ilustra con los axones que se extienden al SNC de las neuronas sensoriales en los insectos.
Durante el proceso de desarrollo de las extremidades , las neuronas proximales son las primeras en formar haces axónicos mientras crecen hacia el SNC. En etapas posteriores del crecimiento de las extremidades, los axones de las neuronas más distales se fasciculan con estos axones pioneros. La eliminación de neuronas pioneras interrumpe la extensión de los axones posteriores, destinados a inervar el SNC. [6] Al mismo tiempo, vale la pena señalar que en la mayoría de los casos las neuronas pioneras no contienen características únicas y su papel en la guía de los axones puede ser sustituido por otras neuronas. Por ejemplo, en los sistemas de conexión retinotectal de Xenopus , los axones pioneros de las células ganglionares de la retina se originan en la parte dorsal del ojo. Sin embargo, si la mitad dorsal del ojo es reemplazada por una parte dorsal menos madura, las neuronas ventrales pueden reemplazar la vía pionera de las células dorsales, después de algún retraso. [7] Los estudios en la retina del pez cebra mostraron que la inhibición de la diferenciación neuronal de los progenitores retinianos tempranos evita que los axones salgan del ojo. El mismo estudio demostró trayectorias de crecimiento aberrantes en neuronas secundarias, siguiendo el crecimiento de neuronas pioneras que carecen de un receptor guía. [8] Por lo tanto, si bien el grado de guía proporcionado por los axones pioneros está en debate y puede variar de un sistema a otro, las vías pioneras proporcionan claramente a las proyecciones seguidoras señales de guía y mejoran su capacidad para navegar hacia el objetivo.
Los primeros axones que se extienden en una vía interactúan estrechamente con las células gliales inmaduras. En el cuerpo calloso en formación de los vertebrados, las células gliales primitivas migran primero a las zonas ependimarias de los hemisferios y la pared del tabique dorsal para formar una estructura transitoria que los axones pioneros de las fibras callosas utilizan para extenderse. [9] La señalización entre la glía y las neuronas en el sistema nervioso en desarrollo es recíproca. Por ejemplo, en el sistema visual de la mosca, los axones de los fotorreceptores requieren de la glía para salir del tallo ocular, mientras que las células gliales dependen de las señales de las neuronas para migrar de regreso a lo largo de los axones. [10]
Los axones en crecimiento también dependen de estructuras neuronales transitorias, como las células guía , durante la búsqueda de caminos. En el sistema visual del ratón , la formación adecuada del quiasma óptico depende de una estructura en forma de V de neuronas transitorias que se cruzan con la glía radial especializada en la línea media del quiasma. Los axones del quiasma crecen a lo largo y alrededor de esta estructura, pero no la invaden. [11] Otro ejemplo es la subplaca en la corteza cerebral en desarrollo que consiste en una capa neuronal transitoria debajo de la zona subventricular y sirve como guía para los axones que ingresan a las capas corticales permanentes. La subplaca es similar a las neuronas quiasmáticas en que estos grupos de células desaparecen (o transitan hacia otros tipos de células) a medida que el cerebro madura. [12] Estos hallazgos indican que las poblaciones de células transitorias pueden cumplir una función de guía importante aunque no tengan ninguna función en el sistema nervioso maduro.
Las primeras descripciones del cono de crecimiento axonal fueron realizadas por el neurobiólogo español Santiago Ramón y Cajal a finales del siglo XIX. [13] Sin embargo, la comprensión de la biología molecular y celular de la guía axonal no comenzaría hasta décadas después. En los últimos treinta años aproximadamente, los científicos han utilizado varios métodos para averiguar cómo los axones encuentran su camino. Gran parte del trabajo inicial en la guía axonal se realizó en el saltamontes , donde se identificaron neuronas motoras individuales y se caracterizaron sus vías. En organismos modelo genéticos como ratones , peces cebra , nematodos y moscas de la fruta , los científicos pueden generar mutaciones y ver si causan errores en la navegación y cómo lo hacen. Los experimentos in vitro pueden ser útiles para la manipulación directa de axones en crecimiento. Un método popular es cultivar neuronas en cultivo y exponer los conos de crecimiento a señales de guía purificadas para ver si estas hacen que los axones en crecimiento giren. Este tipo de experimentos se han realizado a menudo utilizando organismos modelo embriológicos no genéticos tradicionales, como el pollo y la rana africana de uñas . Los embriones de estas especies son fáciles de obtener y, a diferencia de los mamíferos, se desarrollan externamente y son fácilmente accesibles para la manipulación experimental.
Se han estudiado ampliamente varios tipos de vías axónicas en sistemas modelo para comprender mejor los mecanismos de guía axonal. Quizás los dos más destacados sean las comisuras y los mapas topográficos. Las comisuras son sitios donde los axones cruzan la línea media de un lado del sistema nervioso al otro. Los mapas topográficos son sistemas en los que grupos de neuronas en un tejido proyectan sus axones a otro tejido en una disposición organizada de tal manera que se mantienen las relaciones espaciales; es decir, las neuronas adyacentes inervarán regiones adyacentes del tejido objetivo.
Como se ha descrito anteriormente, las señales de orientación axonal suelen clasificarse como "atractivas" o "repulsivas". Esto es una simplificación, ya que los distintos axones responderán a una determinada señal de forma diferente. Además, el mismo cono de crecimiento axonal puede alterar sus respuestas a una determinada señal en función del momento, la experiencia previa con la misma u otras señales y el contexto en el que se encuentra la señal. Estos problemas se ejemplifican durante el desarrollo de las comisuras. La simetría bilateral del sistema nervioso significa que los axones encontrarán las mismas señales a ambos lados de la línea media. Antes de cruzar (ipsilateralmente), el cono de crecimiento debe navegar hacia la línea media y ser atraído por ella. Sin embargo, después de cruzar (contralateralmente), el mismo cono de crecimiento debe ser repelido o perder atracción por la línea media y reinterpretar el entorno para localizar el tejido objetivo correcto.
Dos sistemas experimentales han tenido un impacto particularmente fuerte en la comprensión de cómo se regula la guía axonal de la línea media:
El uso de potentes herramientas genéticas en Drosophila condujo a la identificación de una clase clave de señales de orientación axonal, las Slits, y sus receptores, los Robos (abreviatura de Roundabout). El cordón nervioso ventral parece una escalera, con tres haces axónicos longitudinales (fascículos) conectados por las comisuras, los "peldaños" de la escalera. Hay dos comisuras, anterior y posterior, dentro de cada segmento del embrión.
El modelo actualmente aceptado es que la hendidura, producida por las células de la línea media, repele los axones de la línea media a través de los receptores Robo. Los axones que se proyectan ipsilateralmente (no se cruzan) siempre tienen receptores Robo en su superficie, mientras que los axones comisurales tienen muy poco o ningún Robo en su superficie, lo que les permite ser atraídos a la línea media por las netrinas y, probablemente, otras señales aún no identificadas. Sin embargo, después de cruzarse, los receptores Robo están fuertemente regulados al alza en el axón, lo que permite que la repulsión mediada por Robo supere la atracción a la línea media. Esta regulación dinámica de Robo se logra al menos en parte mediante una molécula llamada Comm (abreviatura de Commissureless), que evita que Robo alcance la superficie celular y la ataque para destruirla. [15]
En la médula espinal de los vertebrados, las neuronas comisurales de las regiones dorsales se proyectan hacia abajo, en dirección a la placa del suelo ventral. Los axones ipsilaterales giran antes de llegar a la placa del suelo para crecer longitudinalmente, mientras que los axones comisurales cruzan la línea media y hacen su giro longitudinal en el lado contralateral. Sorprendentemente, las netrinas, las slits y los robos también desempeñan funciones similares en este sistema. Un misterio destacado era la aparente falta de un gen comm en los vertebrados. Ahora parece que al menos algunas de las funciones de Comm las realiza una forma modificada de Robo llamada Robo3 (o Rig1).
El sistema de la médula espinal fue el primero en demostrar explícitamente la respuesta alterada de los conos de crecimiento a las señales después de la exposición a la línea media. Las neuronas explantadas cultivadas responderían a la Slit suministrada exógenamente según hubieran estado o no en contacto con el tejido de la placa del suelo. [16]
Como se ha descrito anteriormente, los mapas topográficos se producen cuando se mantienen relaciones espaciales entre las poblaciones neuronales y sus campos objetivo en otro tejido. Esta es una característica importante de la organización del sistema nervioso, en particular en los sistemas sensoriales. El neurobiólogo Roger Sperry propuso un modelo profético para el mapeo topográfico mediado por lo que llamó "etiquetas" moleculares. Las cantidades relativas de estas etiquetas variarían en gradientes a lo largo de ambos tejidos. Ahora pensamos en estas etiquetas como ligandos (señales) y sus receptores axónicos. Tal vez la clase de etiquetas mejor entendida sean los ligandos de efrina y sus receptores, los Ephs.
En el tipo más simple de modelo de mapeo, podríamos imaginar un gradiente del nivel de expresión del receptor Eph en un campo de neuronas, como la retina, con las células anteriores expresando niveles muy bajos y las células en la parte posterior expresando los niveles más altos del receptor. Mientras tanto, en el objetivo de las células de la retina (el techo óptico ), los ligandos de efrina están organizados en un gradiente similar: posterior alto a anterior bajo. Los axones de la retina ingresan al techo anterior y avanzan posteriormente. Debido a que, en general, los axones que contienen Eph son repelidos por las efrinas, los axones se volverán cada vez más reacios a avanzar cuanto más avancen hacia el techo posterior. Sin embargo, el grado en que son repelidos está determinado por su propio nivel particular de expresión de Eph, que está determinado por la posición del cuerpo celular neuronal en la retina. Por lo tanto, los axones de la retina anterior, que expresan el nivel más bajo de Ephs, pueden proyectarse al techo posterior, aunque aquí es donde las efrinas se expresan en gran medida. Las células de la retina posterior expresan un alto nivel de Eph y sus axones se detendrán más anteriormente en el tectum.
El gran tamaño y la accesibilidad del embrión de pollo lo han convertido en un organismo modelo favorito para los embriólogos. Los investigadores utilizaron el pollo para purificar bioquímicamente los componentes del tectum que mostraban actividad específica contra los axones de la retina en cultivo. Esto condujo a la identificación de Ephs y Ephrins como las "etiquetas" hipotéticas de Sperry.
La proyección retinotectal también se ha estudiado en Xenopus y en el pez cebra. El pez cebra es un sistema potencialmente poderoso porque los análisis genéticos como los que se realizan en los invertebrados se pueden realizar de manera relativamente sencilla y económica. En 1996, se realizaron análisis a gran escala en el pez cebra, incluidos análisis para la guía y el mapeo de los axones de la retina. Muchos de los mutantes aún no se han caracterizado.
La genética y la bioquímica han identificado un gran conjunto de moléculas que afectan a la guía axonal. No se sabe tan bien cómo encajan todas estas piezas. La mayoría de los receptores de guía axonal activan cascadas de transducción de señales que, en última instancia, conducen a la reorganización del citoesqueleto y a las propiedades adhesivas del cono de crecimiento, que en conjunto son la base de la motilidad de todas las células. Esto ha sido bien documentado en neuronas corticales de mamíferos. [17] Sin embargo, esto plantea la cuestión de cómo las mismas señales pueden dar lugar a un espectro de respuestas de diferentes conos de crecimiento. Puede ser que diferentes receptores activen la atracción o la repulsión en respuesta a una única señal. Otra posibilidad es que los complejos de receptores actúen como "detectores de coincidencias" para modificar las respuestas a una señal en presencia de otra. Una "intercomunicación" de señalización similar podría ocurrir intracelularmente, aguas abajo de los receptores en la superficie celular.
De hecho, se ha demostrado que las respuestas de crecimiento de los axones comisurales son atraídas, reprimidas o silenciadas en presencia del receptor DCC activado por Netrina . [18] Esta actividad variable depende de la expresión del receptor Robo o UNC-5 en los conos de crecimiento. De modo que el receptor Robo activado por Slit provoca un silenciamiento del potencial atractivo de Netrina a través del receptor DCC. Mientras que los conos de crecimiento que expresan el receptor UNC-5 responden de manera repulsiva a la activación de Netrina-DCC. Estos eventos ocurren como consecuencia de interacciones citoplasmáticas entre el receptor DCC activado por Netrina y el receptor Robo o UNC-5, lo que finalmente altera la señalización citoplasmática del DCC. Por lo tanto, la imagen que surge es que el avance del cono de crecimiento es altamente complejo y está sujeto a la plasticidad de las señales de guía, la expresión del receptor, las interacciones del receptor y los mecanismos de señalización posteriores que influyen en la remodelación del citoesqueleto.
La capacidad de los axones para orientarse y ajustar sus respuestas a diversas señales extracelulares, a grandes distancias del cuerpo celular, ha llevado a los investigadores a estudiar las propiedades intrínsecas de los conos de crecimiento. Estudios recientes revelan que las señales de orientación pueden influir en los cambios espaciotemporales de los axones modulando la traducción y degradación local de las proteínas en los conos de crecimiento. [19] Además, esta actividad parece ocurrir independientemente de la expresión génica nuclear distal. De hecho, en las células ganglionares de la retina (RGC) con axones seccionados del soma, los conos de crecimiento continúan rastreando e inervando el tectum de los embriones de Xenopus. [20]
Para dar cabida a esta actividad, se cree que los conos de crecimiento agrupan ARNm que codifican receptores y proteínas de señalización intracelular implicadas en la remodelación del citoesqueleto. [21] En los sistemas de proyección retinotectal de Xenopus, se ha demostrado que la expresión de estas proteínas está influenciada por señales de guía y la posterior activación de la maquinaria de traducción local. La señal atractiva Netrin-1 estimula el transporte de ARNm e influye en la síntesis de β-actina en los filopodios de los conos de crecimiento, para reestructurar y dirigir los conos de crecimiento de RGC en la dirección de la secreción de Netrin. [22] Mientras que se sugiere que la señal repulsiva, Slit, estimula la traducción de Cofilina (un factor despolimerizante de actina) en los conos de crecimiento, lo que conduce a la repulsión axonal. [23] Además, los axones comisurales cortados en pollos muestran la capacidad de traducir y expresar el receptor Eph-A2 durante el cruce de la línea media. [24] Como resultado, los estudios sugieren que la expresión de proteínas locales es un mecanismo conveniente para explicar la naturaleza rápida, dinámica y autónoma del avance del cono de crecimiento en respuesta a las moléculas guía.
Las técnicas de resonancia magnética ponderadas por difusión contemporáneas también pueden revelar el proceso macroscópico del desarrollo axonal. El conectoma , o el gráfico cerebral, se puede construir a partir de datos de resonancia magnética de difusión : los vértices del gráfico corresponden a áreas cerebrales etiquetadas anatómicamente, y dos de esos vértices, digamos u y v , están conectados por un borde si la fase de tractografía del procesamiento de datos encuentra una fibra axonal que conecta las dos áreas, correspondientes a u y v . Se pueden descargar numerosos gráficos cerebrales, calculados a partir del Proyecto Conectoma Humano, del sitio http://braingraph.org. La Dinámica del Conectoma de Consenso (CCD) es un fenómeno notable que se descubrió al disminuir continuamente el parámetro de confianza mínimo en la interfaz gráfica del Servidor de Conectoma de Referencia de Budapest . [25] [26] El Budapest Reference Connectome Server representa las conexiones cerebrales de n=418 sujetos con un parámetro de frecuencia k: Para cualquier k=1,2,...,n se puede ver el gráfico de los bordes que están presentes en al menos k connectomas. Si el parámetro k se disminuye uno por uno desde k=n hasta k=1, entonces aparecen más y más bordes en el gráfico, ya que la condición de inclusión se relaja. La observación sorprendente es que la apariencia de los bordes está lejos de ser aleatoria: se asemeja a una estructura compleja en crecimiento, como un árbol o un arbusto (visualizado en esta animación en YouTube . Se plantea en [27] la hipótesis de que la estructura en crecimiento copia el desarrollo axonal del cerebro humano: las conexiones de desarrollo más temprano (fibras axonal) son comunes en la mayoría de los sujetos, y las conexiones de desarrollo subsiguiente tienen una varianza cada vez mayor, porque sus varianzas se acumulan en el proceso de desarrollo axonal.
La guía axonal está asociada genéticamente con otras características o rasgos. Por ejemplo, los análisis de enriquecimiento de diferentes vías de señalización llevaron al descubrimiento de una asociación genética con el volumen intracraneal. [28]