El naranja de acridina es un compuesto orgánico que actúa como colorante fluorescente selectivo de ácidos nucleicos con propiedades catiónicas útiles para la determinación del ciclo celular. El naranja de acridina es permeable a las células, lo que permite que el colorante interactúe con el ADN por intercalación o con el ARN a través de atracciones electrostáticas . Cuando se une al ADN, el naranja de acridina es muy similar espectralmente a un compuesto orgánico conocido como fluoresceína. El naranja de acridina y la fluoresceína tienen una excitación máxima a 502 nm y 525 nm (verde). Cuando el naranja de acridina se asocia con el ARN, el colorante fluorescente experimenta un cambio de excitación máxima de 525 nm (verde) a 460 nm (azul). El cambio en la excitación máxima también produce una emisión máxima de 650 nm (rojo). El naranja de acridina es capaz de soportar ambientes de pH bajo, lo que permite que el colorante fluorescente penetre en orgánulos ácidos como los lisosomas y los fagolisosomas que son orgánulos unidos a la membrana esenciales para la hidrólisis ácida o para producir productos de fagocitosis de células apoptóticas. El naranja de acridina se utiliza en microscopía de epifluorescencia y citometría de flujo . La capacidad de penetrar las membranas celulares de los orgánulos ácidos y las propiedades catiónicas del naranja de acridina permiten que el colorante diferencie entre varios tipos de células (es decir, células bacterianas y glóbulos blancos). El cambio en las longitudes de onda de excitación y emisión máximas proporciona una base para predecir la longitud de onda en la que se teñirán las células. [1]
Cuando el pH del entorno es de 3,5, el naranja de acridina se excita con la luz azul (460 nm). Cuando el naranja de acridina se excita con la luz azul, el colorante fluorescente puede teñir de forma diferencial las células humanas de verde y las células procariotas de naranja (600 nm), lo que permite una detección rápida con un microscopio de fluorescencia. La capacidad de tinción diferencial del naranja de acridina permite un escaneo rápido de frotis de muestras con aumentos inferiores de 400x en comparación con las tinciones de Gram que funcionan con un aumento de 1000x. La diferenciación de las células se ve facilitada por un fondo oscuro que permite detectar fácilmente los organismos coloreados. El marcado contraste proporciona un mecanismo para contar la cantidad de organismos presentes en una muestra. Cuando el naranja de acridina se une al ADN, el colorante exhibe una excitación máxima a 502 nm, lo que produce una emisión máxima de 525 nm. Cuando se une al ARN, el naranja de acridina muestra un valor de emisión máximo de 650 nm y un valor de excitación máximo de 460 nm. El valor máximo de excitación y emisión que se produce cuando la naranja de acridina se une al ARN son el resultado de interacciones electrostáticas y la intercalación entre la molécula de acridina y los pares de bases de ácidos nucleicos presentes en el ARN y el ADN. [2]
Los colorantes de acridina se preparan mediante la condensación de 1,3-diaminobenceno con benzaldehídos adecuados. El naranja de acridina se deriva del dimetilamino benzaldehído y N , N -dimetil-1,3-diaminobenceno. [3] También se puede preparar mediante la reacción de Eschweiler-Clarke de 3,6-acridindiamina.
El naranja de acridina se deriva de la molécula orgánica acridina, que fue descubierta por primera vez por Carl Grabe y Heinrich Caro, quienes aislaron la acridina hirviendo carbón en Alemania a fines del siglo XIX. La acridina tiene factores antimicrobianos útiles en bacterias resistentes a los medicamentos y para aislar bacterias en varios entornos. [4] El naranja de acridina a mediados del siglo XX se utilizó para examinar el contenido microbiano encontrado en el suelo y los recuentos directos de bacterias acuáticas. Además, el método de recuento directo de naranja de acridina (AODC) resultó útil en la enumeración de bacterias encontradas en vertederos. La técnica de filtro epifluorescente directo (DEFT) que utiliza naranja de acridina es un método conocido para examinar el contenido microbiano en alimentos y agua. El uso de naranja de acridina en aplicaciones clínicas ha sido ampliamente aceptado, centrándose principalmente en resaltar bacterias en cultivos de sangre. Estudios pasados y presentes que comparan la tinción con naranja de acridina con subcultivos ciegos para la detección de hemocultivos positivos mostraron que la naranja de acridina es un procedimiento de tinción simple, económico y rápido que parece ser más sensible que la tinción de Gram para detectar microorganismos en el líquido cefalorraquídeo y otros materiales clínicos y no clínicos. [3]
El naranja de acridina ha sido ampliamente aceptado y utilizado en muchas áreas diferentes, como la microscopía de epifluorescencia y la evaluación de la calidad de la cromatina de los espermatozoides . El naranja de acridina es útil en la detección rápida de muestras normalmente estériles. Cuando se utiliza naranja de acridina con citometría de flujo, la tinción diferencial se utiliza para medir la desnaturalización del ADN [5] y el contenido celular de ADN versus ARN [6] en células individuales, o para detectar daños en el ADN en espermatozoides infértiles. [7] El naranja de acridina se recomienda para el uso de la detección microscópica fluorescente de microorganismos en frotis preparados a partir de materiales clínicos y no clínicos. La tinción con naranja de acridina debe realizarse a un pH ácido para obtener la tinción diferencial, que permite que las células bacterianas se tiñen de naranja y los componentes del tejido se tiñen de amarillo o verde. [8]
El naranja de acridina se utiliza como agente de curado para curar marcadores seleccionables en organismos resistentes a antibióticos presentes en una muestra. Cuando los aislados se someten a curado en presencia de naranja de acridina, se registró que un número sustancial se curó de al menos un marcador resistente. [ cita requerida ] El naranja de acridina también se utiliza para teñir vacuolas ácidas ( lisosomas , endosomas y autofagosomas ), ARN y ADN en células vivas. Este método es una forma barata y fácil de estudiar la vacuolización lisosomal , la autofagia y la apoptosis . El color de emisión del naranja de acridina cambia de amarillo a naranja y a rojo a medida que baja el pH en una vacuola ácida de la célula viva. En condiciones específicas de fuerza iónica y concentración, el naranja de acridina emite fluorescencia roja cuando se une al ARN mediante interacciones de apilamiento y fluorescencia verde cuando se une al ADN por intercalación . Dependiendo de la concentración de naranja de acridina, los núcleos pueden emitir fluorescencia verde amarillenta en células no tratadas y fluorescencia verde cuando la síntesis de ARN es inhibida por compuestos como la cloroquina . [9] La naranja de acridina se puede utilizar junto con bromuro de etidio o yoduro de propidio para diferenciar entre células viables, apoptóticas y necróticas . Además, la naranja de acridina se puede utilizar en muestras de sangre para hacer que el ADN bacteriano emita fluorescencia, lo que ayuda en el diagnóstico clínico de infecciones bacterianas, como la meningitis. [3]