La iluminación de Köhler es un método de iluminación de muestras utilizado para la microscopía óptica con luz transmitida y reflejada (trans y epiiluminada) . La iluminación de Köhler actúa para generar una iluminación uniforme de la muestra y garantiza que no se vea una imagen de la fuente de iluminación (por ejemplo, un filamento de lámpara halógena ) en la imagen resultante. La iluminación de Köhler es la técnica predominante para la iluminación de muestras en la microscopía óptica científica moderna. Requiere elementos ópticos adicionales que son más caros y pueden no estar presentes en los microscopios ópticos más básicos.
Antes de la iluminación de Köhler, la iluminación crítica era la técnica predominante para la iluminación de muestras. La iluminación crítica tiene la principal limitación de que la imagen de la fuente de luz (normalmente una bombilla ) cae en el mismo plano que la imagen de la muestra, es decir, el filamento de la bombilla es visible en la imagen final. La imagen de la fuente de luz se suele denominar imagen del filamento . Por tanto, la iluminación crítica proporciona una iluminación desigual de la muestra; las regiones brillantes de la imagen del filamento iluminan esas regiones de la muestra con más intensidad. La iluminación desigual es indeseable, ya que puede introducir artefactos como deslumbramiento y sombras en la imagen.
Se pueden utilizar varios métodos para difundir la imagen del filamento, como reducir la potencia de la fuente de luz o utilizar una bombilla de vidrio opalino o un difusor de vidrio opalino entre la bombilla y la muestra. Todos estos métodos son, hasta cierto punto, funcionales para reducir la irregularidad de la iluminación, pero todos reducen la intensidad de la iluminación y alteran el rango de longitudes de onda de la luz que llega a la muestra.
Para solucionar estas limitaciones, August Köhler diseñó un método de iluminación que utiliza una imagen perfectamente desenfocada de la fuente de luz para iluminar la muestra. Este trabajo se publicó en 1893 en la Zeitschrift für wissenschaftliche Mikroskopie [1] y pronto fue seguido por la publicación de una traducción al inglés en el Journal of the Royal Microscopical Society [2] .
La iluminación de Köhler también se ha desarrollado en el contexto de la óptica sin formación de imágenes . [3]
La principal limitación de la iluminación crítica es la formación de una imagen de la fuente de luz en el plano de la imagen de la muestra. La iluminación de Köhler soluciona este problema garantizando que la imagen de la fuente de luz esté perfectamente desenfocada en el plano de la muestra y sus planos de imagen conjugados . En un diagrama de rayos de la trayectoria de la luz de iluminación, esto se puede ver como los rayos formadores de imágenes que pasan en paralelo a través de la muestra.
La iluminación Köhler requiere varios componentes ópticos para funcionar:
Estos componentes se encuentran en este orden entre la fuente de luz y la muestra y controlan la iluminación de la muestra. Las lentes colectoras/de campo actúan para recoger la luz de la fuente de luz y enfocarla en el plano del diafragma del condensador. La lente del condensador actúa para proyectar esta luz, sin enfocarla, a través de la muestra. Este esquema de iluminación crea dos conjuntos de planos de imagen conjugados, uno con la fuente de luz y sus imágenes y otro con la muestra y sus imágenes. Estos dos conjuntos de planos de imagen se encuentran en los siguientes puntos (consulte la imagen para ver los números y las letras):
La principal ventaja de la iluminación Köhler es la iluminación uniforme de la muestra. Esto reduce los artefactos de imagen y proporciona un alto contraste de la muestra. La iluminación uniforme de la muestra también es fundamental para técnicas de iluminación avanzadas, como el contraste de fase y la microscopía de contraste de interferencia diferencial .
El ajuste del diafragma del condensador altera el contraste de la muestra . Además, la modificación del tamaño del diafragma del condensador permite ajustar la profundidad de campo de la muestra modificando la apertura numérica efectiva del microscopio. La función del diafragma del condensador es análoga a la apertura en fotografía, aunque el diafragma del condensador de un microscopio funciona controlando la iluminación de la muestra, mientras que la apertura de una cámara funciona controlando la iluminación del detector.
La modificación del diafragma del condensador permite ajustar libremente la cantidad de luz que entra en la muestra sin alterar las longitudes de onda de la luz presente, a diferencia de la reducción de potencia de la fuente de luz con iluminación crítica (que cambia la temperatura de color de la lámpara). Este ajuste siempre va acompañado de una modificación de la apertura numérica del sistema, como se indicó anteriormente, por lo que sigue siendo necesario ajustar la intensidad de la fuente de iluminación por otros medios.
Mediante el ajuste del diafragma de campo, la imagen de la apertura del diafragma de campo en el plano de muestra se establece en un tamaño ligeramente mayor que la región de la muestra que se representa (que corresponde a su vez a la porción de la imagen de muestra proyectada hacia el tope de campo del ocular ). Como el diafragma de campo, la muestra y el tope de campo del ocular se encuentran todos en planos de imagen conjugados , este ajuste permite que los rayos de iluminación llenen completamente el campo de visión del ocular, al tiempo que minimiza la cantidad de luz extraña que debe ser bloqueada por el tope de campo del ocular. Dicha luz extraña se dispersa dentro del sistema y degrada el contraste.
Los microscopios que utilizan iluminación Köhler deben revisarse periódicamente para comprobar que estén correctamente alineados. El procedimiento de realineación prueba si los componentes ópticos correctos están enfocados en los dos conjuntos de planos de imagen conjugados: los planos de imagen de la fuente de luz y los planos de imagen de la muestra.
La alineación de los componentes ópticos en el plano de la imagen de la muestra se realiza normalmente cargando primero una muestra de prueba y enfocándola moviendo el objetivo o la muestra. A continuación, se cierra parcialmente el diafragma de campo; los bordes del diafragma deben estar en los mismos planos de imagen conjugados que la muestra, por lo tanto, deben aparecer enfocados. El enfoque se puede ajustar subiendo o bajando las lentes del condensador y el diafragma. Por último, se vuelve a abrir el diafragma de campo justo más allá del campo de visión.
Para comprobar la alineación de los componentes en el plano de imagen de la fuente de luz, se debe retirar el ocular para permitir la observación del plano de imagen intermedio (la posición del diafragma del ocular) ya sea directamente o utilizando un telescopio de fase / lente Bertrand . La fuente de luz (por ejemplo, el filamento de la bombilla) y los bordes del diafragma del condensador deben aparecer enfocados. Todos los componentes ópticos en el plano focal posterior del objetivo (por ejemplo, el anillo de fase para la microscopía de contraste de fase) y en el diafragma del condensador (por ejemplo, el anillo para la microscopía de contraste de fase) también deben aparecer enfocados.