La hemocianina de lapa ojo de cerradura (KLH) es una metaloproteína grande, multisubunitaria, transportadora de oxígeno que se encuentra en la hemolinfa de la lapa gigante ojo de cerradura , Megathura crenulata , una especie de lapa ojo de cerradura que vive en la costa de California , desde la Bahía de Monterey hasta la Isla Asunción en Baja California . [2]
Existen dos genes de hemocianina de lapa californiana , denominados KLH1 y KLH2, que comparten alrededor del 60% de identidad a nivel proteico. Ambos codifican proteínas glicosiladas grandes que constan de alrededor de 3400 aminoácidos y un peso molecular de alrededor de 390.000 daltons , excluyendo la glicosilación. La proteína se oligomeriza para formar un complejo didecamérico en forma de barril que se compone de 20 monómeros. Cada dominio de una subunidad de KLH contiene dos átomos de cobre que juntos unen una sola molécula de oxígeno (O 2 ). Cuando el oxígeno se une a la hemocianina, la molécula adquiere un color azul opalescente transparente distintivo , debido al estado Cu 2+ del cobre. En ausencia de oxígeno, el cobre unido se encuentra como Cu 1+ y la hemocianina es incolora. La proteína KLH es potentemente inmunogénica, pero no causa una respuesta inmunitaria adversa en humanos. Por lo tanto, es muy apreciada como proteína portadora de vacunas. Debido a su tamaño y glicosilación, la proteína KLH no se puede reproducir sintéticamente; solo está disponible como un producto biológico purificado de la lapa Megathura crenulata .
La KLH se purifica a partir de la hemolinfa de Megathura crenulata mediante una serie de pasos que normalmente incluyen precipitación con sulfato de amonio y diálisis, y puede implicar purificación cromatográfica para obtener la máxima pureza. La purificación de la KLH también puede incluir la eliminación de endotoxinas , pero este paso suele ser innecesario porque la endotoxina actúa como adyuvante cuando se inyecta para la producción de anticuerpos.
Si la proteína se desnaturaliza o si los iones de cobre se pierden en el proceso de purificación, el color azul opalescente desaparece y la solución se vuelve de un color grisáceo opaco. La desnaturalización de KLH también produce una tendencia de la proteína a agregarse y precipitarse de la solución.
La hemocianina de lapa (KLH) se utiliza ampliamente como proteína transportadora en la producción de anticuerpos para investigación, biotecnología y aplicaciones terapéuticas . Los haptenos son sustancias con un peso molecular bajo, como péptidos , proteínas pequeñas y moléculas de fármacos que generalmente no son inmunogénicas y requieren la ayuda de una proteína transportadora para estimular una respuesta del sistema inmunológico en forma de producción de anticuerpos. [3] KLH es la proteína transportadora más utilizada para este propósito. KLH es una proteína transportadora eficaz por varias razones. Su gran tamaño y numerosos epítopos generan una respuesta inmune sustancial, y la abundancia de residuos de lisina para acoplar haptenos permite una alta relación hapteno:proteína transportadora, lo que aumenta la probabilidad de generar anticuerpos específicos de hapteno. Además, debido a que KLH se deriva de la lapa, un gasterópodo, está filogenéticamente distante de las proteínas de los mamíferos, lo que reduce los falsos positivos en las técnicas de investigación basadas en la inmunología en organismos modelo de mamíferos.
La KLH también puede ser una molécula difícil de manipular debido a su propensión a agregarse y precipitarse. Los agregados siguen siendo inmunogénicos, pero limitan la capacidad de conjugar haptenos y son difíciles de manipular en el laboratorio. Una preparación de KLH de alta calidad con un color azul opalescente transparente es el mejor indicador de la solubilidad de la KLH.
Los haptenos se pueden acoplar a KLH mediante varios métodos. Se puede realizar un acoplamiento simple de un solo paso utilizando el reticulante de carbodiimida EDC para unir covalentemente los carboxilos a las aminas primarias. Este método es el más simple de realizar y la orientación "aleatoria" permite la generación de anticuerpos contra todos los epítopos posibles, pero generalmente da como resultado cierto grado de polimerización, lo que disminuye la solubilidad y hace que el conjugado sea más difícil de manipular.
La KLH se puede activar con el agente de reticulación Sulfo-SMCC, que convierte los residuos de lisina en grupos maleimida reactivos con sulfhidrilo . A continuación, se puede hacer reaccionar un hapteno que contenga sulfhidrilo con la KLH para completar el inmunógeno sin provocar polimerización. La especificidad de esta reacción es ideal para situaciones en las que la cisteína se encuentra lejos del epítopo deseado (por ejemplo, en péptidos en los que se puede añadir una cisteína terminal a cualquiera de los extremos del péptido). La KLH activada con maleimida, en la que se ha completado la primera parte de este procedimiento de dos pasos, está disponible comercialmente.
Se está probando KLH en una variedad de vacunas contra el cáncer , incluido el linfoma no Hodgkin , el melanoma cutáneo y el cáncer de mama y de vejiga. [4] [5] Estas vacunas contienen antígenos específicos asociados a tumores conjugados con KLH para estimular respuestas inmunes antitumorales que pueden destruir las células tumorales.
El creciente interés en las vacunas terapéuticas (es decir, inmunoterapias activas) para el cáncer y la eficacia documentada de KLH como proteína transportadora superior para las vacunas contra el cáncer están creando un mercado biofarmacéutico significativo para las formulaciones de KLH. [6]
Se han desarrollado ensayos para monitorear las respuestas inmunes humorales contra KLH en suero humano para facilitar el uso óptimo de las aplicaciones biomédicas de KLH. [7]
Debido a los usos beneficiosos de la KLH, la lapa gigante , de la que se deriva la KLH, ha sido objeto de creciente preocupación entre los biólogos pesqueros del estado de California debido a la posibilidad de una sobreexplotación de la especie con fines comerciales. Las lapas gigantes no son una especie abundante para empezar, [8] y algunos buceadores han informado de una disminución de sus poblaciones. [2] En un informe de 2006 del Instituto de Ciencias Marinas de la Universidad de California, Santa Bárbara, los científicos afirman que están "muy preocupados por la pesca emergente" de lapas gigantes y sugieren que existe el potencial de "diezmar sus poblaciones". [9] Para ayudar a garantizar una fuente segura a largo plazo de KLH para los numerosos programas de investigación biomédica patrocinados por el gobierno federal que utilizan KLH, las agencias federales, incluidos los Institutos Nacionales de Salud [10] y la Fundación Nacional de Ciencias [11], también han patrocinado investigaciones para establecer una producción de maricultura sostenible de la lapa gigante.
{{cite journal}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )