La electroforesis de afinidad es un nombre general para muchos métodos analíticos utilizados en bioquímica y biotecnología . Se puede obtener información tanto cualitativa como cuantitativa a través de la electroforesis de afinidad. [1] La electroforesis cruzada, el primer método de electroforesis de afinidad, fue creada por Nakamura et al. Los complejos enzima-sustrato se han detectado utilizando electroforesis cruzada. [2] [3] [4] [5] [6] Los métodos incluyen el llamado ensayo de cambio de movilidad electroforética , electroforesis de cambio de carga y electroforesis capilar de afinidad . [1] Los métodos se basan en cambios en el patrón electroforético de moléculas (principalmente macromoléculas ) a través de la interacción bioespecífica o la formación de complejos . La interacción o unión de una molécula, cargada o no cargada, normalmente cambiará las propiedades electroforéticas de una molécula. [7] [1] Las proteínas de membrana pueden identificarse por un cambio en la movilidad inducido por un detergente cargado . Los ácidos nucleicos o fragmentos de ácidos nucleicos pueden caracterizarse por su afinidad con otras moléculas. Los métodos se han utilizado para la estimación de constantes de unión , como por ejemplo en la electroforesis de afinidad de lectinas o la caracterización de moléculas con características específicas como el contenido de glucanos o la unión de ligandos . [1] Para las enzimas y otras proteínas que se unen a ligandos, la electroforesis unidimensional similar a la contraelectroforesis o a la "inmunoelectroforesis de cohetes" puede utilizarse como una cuantificación alternativa de la proteína. [8] Algunos de los métodos son similares a la cromatografía de afinidad mediante el uso de ligandos inmovilizados .
Actualmente, se están realizando investigaciones para desarrollar nuevas formas de utilizar el conocimiento ya asociado con la electroforesis de afinidad para mejorar su funcionalidad y velocidad, así como intentos de mejorar los métodos ya establecidos y adaptarlos para realizar tareas específicas.
La electroforesis en gel de agarosa, un tipo de ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética (AMSA), se utiliza para separar los complejos de aminoácidos unidos a proteínas de los aminoácidos libres. Utilizando un voltaje bajo (~10 V/cm) para minimizar el riesgo de daño por calor, se hace pasar electricidad a través de un gel de agarosa. Cuando se disuelve en una solución tamponada caliente (50 a 55 grados Celsius), produce una solución viscosa, pero cuando se enfría, se solidifica como un gel. Las proteínas séricas, la hemoglobina, los ácidos nucleicos, los productos de la reacción en cadena de la polimerasa, etc. se separan utilizando este método. Los grupos sulfato fijos de la agarosa pueden causar una electroendosmosis mejorada, lo que reduce la resolución de la banda. El uso de un gel de agarosa ultrapuro con poco contenido de sulfato puede detener esto. [ cita requerida ]
Esta técnica utiliza un alto voltaje ( ≥ 20 V/cm ) con un tampón Tris-borato 0,5× que se ejecuta a través de un gel de agarosa. [9] Este método se diferencia de la electroforesis en gel de agarosa tradicional al utilizar un voltaje más alto para facilitar un tiempo de ejecución más corto y producir una resolución de banda más alta. Otros factores incluidos en el desarrollo de la técnica de electroforesis rápida en gel de agarosa son el espesor del gel y el porcentaje de agarosa dentro del gel.
La electroforesis de afinidad con boronato utiliza geles de acrilamida impregnados con ácido borónico para purificar el NAD-ARN. Esta purificación permite a los investigadores medir fácilmente la actividad cinética de las enzimas de desprotección del NAD-ARN. [10]
La electroforesis capilar de afinidad (ECA) se refiere a una serie de técnicas que se basan en interacciones de unión específicas y no específicas para facilitar la separación y detección a través de un enfoque de formulario de acuerdo con la teoría de la electromigración . [11] [12] Utilizando las interacciones intermoleculares entre moléculas que ocurren en solución libre o movilizadas sobre un soporte sólido, la ECA permite la separación y cuantificación de concentraciones de analito y constantes de unión y disociación entre moléculas. [13] [14] Como sondas de afinidad en CAE, se emplean compuestos marcados con fluoróforos con afinidades por las moléculas objetivo. [15] Con la ECA, los científicos esperan desarrollar candidatos a fármacos de unión fuerte, comprender y medir la actividad enzimática y caracterizar las cargas en las proteínas. [16] La electroforesis capilar de afinidad se puede dividir en tres técnicas distintas: electroforesis de no equilibrio de mezclas de muestras equilibradas, ECA de equilibrio dinámico y ECA basada en afinidad. [13]
La electroforesis sin equilibrio de mezclas de muestras equilibradas se utiliza generalmente en la separación y el estudio de interacciones de unión de proteínas grandes e implica la combinación tanto del analito como de su molécula receptora en una muestra premezclada.
Estas moléculas receptoras a menudo toman la forma de sondas de afinidad que consisten en moléculas marcadas con fluoróforos que se unirán a las moléculas objetivo que se mezclan con la muestra que se está probando. [13] Esta mezcla, y sus complejos posteriores, luego se separan mediante electroforesis capilar. [13] Debido a que la mezcla original de analito y molécula receptora estaban unidas en un equilibrio, la disociación lenta de estas dos moléculas unidas durante el experimento electroforético dará como resultado su separación y un cambio posterior en el equilibrio hacia una mayor disociación. [17] El patrón de frotis característico producido por la liberación lenta del analito del complejo durante el experimento se puede utilizar para calcular la constante de disociación del complejo. [17]
La electroforesis capilar de afinidad de equilibrio dinámico implica la combinación del analito presente en la muestra y su molécula receptora presente en la solución tamponada en el tubo capilar, de modo que la unión y la separación solo se producen en el instrumento. [13] Se supone que para la electroforesis capilar de afinidad de equilibrio dinámico la unión ligando-receptor se produce rápidamente cuando se mezclan el analito y la solución tampón. Las constantes de unión se derivan generalmente de esta técnica en función del cambio de migración máxima del receptor, que depende de la concentración del analito en la muestra. [13]
La electroforesis capilar basada en afinidad, también conocida como cromatografía de electroafinidad capilar (CEC), implica la unión del analito en la muestra a una molécula receptora inmovilizada en la pared capilar, microperlas o microcanales. [18] La CEC ofrece la mayor eficacia de separación de las tres técnicas de ECA, ya que los componentes de la muestra no matriciales se eliminan y luego se libera el ligando y se analiza. [13]
La electroforesis capilar de afinidad aprovecha las ventajas de la electroforesis capilar y las aplica al estudio de las interacciones de proteínas. [16] La ACE es ventajosa porque tiene una alta eficiencia de separación, tiene un tiempo de análisis más corto, se puede ejecutar a pH fisiológico e implica un bajo consumo de ligando/moléculas. [19] [20] Además, no es necesario conocer la composición de la proteína de interés para ejecutar estudios de ACE. [16] Sin embargo, la principal desventaja es que no proporciona mucha información estequiométrica sobre la reacción que se está estudiando. [20]
La electroforesis en gel de poliacrilamida con trampa de afinidad (PAGE) se ha convertido en uno de los métodos más populares de separación de proteínas. Esto no se debe solo a sus cualidades de separación, sino también a que se puede utilizar junto con una variedad de otros métodos analíticos, como la espectrometría de masas y el Western blotting. [14] Además de ayudar a aislar y purificar proteínas de muestras biológicas, se prevé que la AT-PAGE sea útil en los análisis de variaciones en la expresión de proteínas particulares, así como en las investigaciones de modificaciones postraduccionales de proteínas. [21] Este método utiliza un enfoque de dos pasos. Primero, una muestra de proteína se pasa a través de un gel de poliacrilamida mediante electroforesis. Luego, la muestra se transfiere a un gel de poliacrilamida diferente (el gel con trampa de afinidad) donde se inmovilizan las sondas de afinidad. Las proteínas que no tienen afinidad por las sondas de afinidad pasan a través del gel de trampa de afinidad, y las proteínas con afinidad por las sondas serán "atrapadas" por las sondas de afinidad inmóviles. Estas proteínas atrapadas se visualizan e identifican mediante espectrometría de masas después de la digestión en gel. [14]
La electroforesis de afinidad de fosfato utiliza una sonda de afinidad que consiste en una molécula que se une específicamente a iones de fosfato divalentes en solución acuosa neutra, conocida como "Phos-Tag". Este método también utiliza un gel de separación hecho de un monómero Phos-Tag dependiente de acrilamida que se copolimeriza. Las proteínas fosforiladas migran lentamente en el gel en comparación con las proteínas no fosforiladas. Esta técnica le da al investigador la capacidad de observar las diferencias en los estados de fosforilación de cualquier proteína dada. [14] Esta técnica permite la detección de bandas distintas incluso en moléculas de proteína que tienen la misma cantidad de residuos de aminoácidos fosforilados pero que están fosforilados en diferentes ubicaciones de aminoácidos. [22] [23]