Dispersión de luz electroforética

La dispersión de luz electroforética (también conocida como electroforesis láser Doppler y dispersión de luz por análisis de fase ) se basa en la dispersión dinámica de la luz . El cambio de frecuencia o de fase de un rayo láser incidente depende de la movilidad de las partículas dispersas . Con la dispersión dinámica de la luz , el movimiento browniano provoca el movimiento de partículas. En la dispersión electroforética de la luz, el campo eléctrico oscilante realiza esta función.

El método se utiliza para medir la movilidad electroforética , a partir de la cual se puede calcular el potencial zeta . Los instrumentos para aplicar el método están disponibles comercialmente de varios fabricantes. El último conjunto de cálculos requiere información sobre la viscosidad y la permitividad dieléctrica del medio de dispersión ; También se requiere una teoría de electroforesis adecuada . A menudo es necesaria la dilución de la muestra para eliminar la dispersión múltiple del rayo láser incidente y/o las interacciones de las partículas.

Instrumentación

Fig. 3. Sistema óptico heterodino comercial de un instrumento de dispersión de luz electroforética con un modulador (de la Ref. 11).

Un rayo láser atraviesa la celda de electroforesis, irradia las partículas dispersas en ella y es dispersado por las partículas. La luz dispersada es detectada por un fotomultiplicador después de pasar a través de dos orificios. Hay dos tipos de sistemas ópticos: heterodinos y marginales. Ware y Flygare ^[1] desarrollaron un instrumento ELS de tipo heterodino, que fue el primer instrumento de este tipo. En un instrumento ELS de óptica marginal, ^[2] un rayo láser se divide en dos haces. Estos se cruzan dentro de la celda de electrofresis en un ángulo fijo para producir un patrón de franjas. La luz dispersada por las partículas, que migra dentro de la franja, está modulada en intensidad. Los cambios de frecuencia de ambos tipos de óptica obedecen a las mismas ecuaciones. Los espectros observados se parecen entre sí. Oká y col. desarrolló un instrumento ELS de óptica de tipo heterodino ^[3] que ahora está disponible comercialmente. Su óptica se muestra en la Fig. 3.

Si las frecuencias de los rayos láser que se cruzan son las mismas, entonces no es posible determinar la dirección del movimiento de las partículas migratorias. En cambio, sólo se puede determinar la magnitud de la velocidad (es decir, la rapidez). Por tanto, no se puede determinar el signo del potencial zeta. Esta limitación se puede superar cambiando la frecuencia de uno de los haces con respecto al otro. Este cambio puede denominarse modulación de frecuencia o, más coloquialmente, simplemente modulación. Los moduladores utilizados en ELS pueden incluir espejos accionados piezoeléctricamente o moduladores acústico-ópticos. Este esquema de modulación también se emplea mediante el método de dispersión de luz heterodina.

La dispersión de luz por análisis de fase (PALS) es un método para evaluar el potencial zeta, en el que se analiza la tasa de cambio de fase de la interferencia entre la luz dispersada por la muestra y el haz de referencia modulado. Esta velocidad se compara con una onda sinusoidal generada matemáticamente y predeterminada por la frecuencia del modulador. ^[4] Ya no es necesaria la aplicación de campos grandes, que pueden provocar el calentamiento de la muestra y la descomposición de los coloides. Pero cualquier no linealidad del modulador o cualquier cambio en las características del modulador con el tiempo significará que la onda sinusoidal generada ya no reflejará las condiciones reales y las mediciones del potencial zeta resultantes se volverán menos confiables.

Un desarrollo posterior de la técnica PALS es la denominada técnica "PALS monitoreada continuamente" (cmPALS), que aborda la no linealidad de los moduladores. Un modulador adicional detecta la interferencia entre la luz láser modulada y no modulada. Por tanto, su frecuencia de batido es únicamente la frecuencia de modulación y, por tanto, es independiente del movimiento electroforético de las partículas. Esto da como resultado mediciones más rápidas, una mayor reproducibilidad incluso con campos eléctricos aplicados bajos, así como una mayor sensibilidad de la medición. ^[5]

Dispersión de luz heterodina

La frecuencia de la luz dispersada por las partículas sometidas a electroforesis se desplaza según la cantidad del efecto Doppler, respecto a la de la luz incidente: . El desplazamiento se puede detectar mediante una óptica heterodina en la que la luz dispersante se mezcla con la luz de referencia. La función de autocorrelación de la intensidad de la luz mixta, puede describirse aproximadamente mediante la siguiente función coseno amortiguada [7]. ${\displaystyle \upsilon _{D}\,}$ ${\displaystyle \upsilon \,}$ ${\displaystyle g(\tau )\,}$

${\displaystyle g(\tau )=A+B\exp(-\Gamma \tau )\cos(2\pi \upsilon _{o})+C\exp(-2\Gamma \tau )\,\qquad (1)}$

donde es una constante de desintegración y A, B y C son constantes positivas que dependen del sistema óptico. ${\displaystyle \Gamma \,}$

La frecuencia de amortiguación es una frecuencia observada y es la diferencia de frecuencia entre la luz dispersa y la de referencia. ${\displaystyle \upsilon _{o}\,}$

${\displaystyle \upsilon _{o}=|\upsilon _{s}-\upsilon _{r}|=|(\upsilon _{i}+\upsilon _{D})-(\upsilon _{i}+\upsilon _{M})|\qquad (2)}$

donde es la frecuencia de la luz dispersada, la frecuencia de la luz de referencia, la frecuencia de la luz incidente (luz láser) y la frecuencia de modulación. ${\displaystyle \upsilon _{s}\,}$ ${\displaystyle \upsilon _{r}\,}$ ${\displaystyle \upsilon _{i}\,}$ ${\displaystyle \upsilon _{M}\,}$

El espectro de potencia de la luz mixta, es decir, la transformada de Fourier de , proporciona un par de funciones de Lorenz al tener un ancho medio de en la mitad del máximo. ${\displaystyle g(\tau )\,}$ ${\displaystyle \pm \Delta \upsilon \,}$ ${\displaystyle \Gamma /2\pi \,}$

Además de estos dos, el último término de la ecuación (1) da otra función de Lorenz en ${\displaystyle \upsilon =0\,}$

El desplazamiento Doppler de frecuencia y la constante de caída dependen de la geometría del sistema óptico y se expresan respectivamente mediante las ecuaciones.

${\displaystyle \upsilon _{D}={\frac {Vq}{2\pi }}\qquad (3)}$

y

${\displaystyle \Gamma =D|q|^{2}\qquad (4)}$

donde es la velocidad de las partículas, es la amplitud del vector de dispersión y es la constante de difusión traslacional de las partículas. ${\displaystyle \ V\,}$ ${\displaystyle \ q\,}$ ${\displaystyle \ D\,}$

La amplitud del vector de dispersión viene dada por la ecuación ${\displaystyle \ q\,}$

${\displaystyle \ |q|={\frac {4\pi n}{\lambda _{0}}}\sin \left({\frac {\theta }{2}}\right)\qquad (5)}$

Dado que la velocidad es proporcional al campo eléctrico aplicado, la movilidad electroforética aparente se define mediante la ecuación ${\displaystyle \ V\,}$ ${\displaystyle \ E\,}$ ${\displaystyle \ \mu _{obs}\,}$

${\displaystyle \ {\vec {V}}=\mu _{obs}{\vec {E}}\qquad (6)}$

Finalmente, la relación entre la frecuencia de desplazamiento Doppler y la movilidad viene dada para el caso de la configuración óptica de la Fig. 3 mediante la ecuación

${\displaystyle \upsilon _{D}=\mu _{obs}{\frac {nE}{\lambda _{0}}}\sin \theta \qquad (7)}$

donde es la intensidad del campo eléctrico, el índice de refracción del medio, la longitud de onda de la luz incidente en el vacío y el ángulo de dispersión. El signo de es el resultado del cálculo vectorial y depende de la geometría de la óptica. ${\displaystyle \ E\,}$ ${\displaystyle \ n\,}$ ${\displaystyle \ \lambda _{0}\,}$ ${\displaystyle \ \theta \,}$ ${\displaystyle \ v_{D}\,}$

La frecuencia espectral se puede obtener según la ecuación. (2). Cuando , la ecuación. (2) se modifica y expresa como ${\displaystyle \ |\upsilon _{M}|>|\upsilon _{D}|\,}$

${\displaystyle \upsilon _{p}=\upsilon _{o}=\pm (\upsilon _{D}-|\upsilon _{M}|)\qquad (8)}$

La frecuencia de modulación se puede obtener como la frecuencia de amortiguación sin aplicar un campo eléctrico. ${\displaystyle \upsilon _{M}\,}$

El diámetro de la partícula se obtiene suponiendo que la partícula es esférica. Esto se llama diámetro hidrodinámico . ${\displaystyle \ d_{H}\,}$

${\displaystyle \ d_{H}={\frac {k_{B}T}{3\pi \eta D}}\qquad (10)}$

donde es el coeficiente de Boltzmann , es la temperatura absoluta y la viscosidad dinámica del fluido circundante. ${\displaystyle \ k_{B}\,}$ ${\displaystyle \ T\,}$ ${\displaystyle \ \eta \,}$

Perfil de flujo electroosmótico.

La Figura 4 muestra dos ejemplos de funciones de autocorrelación heterodina de luz dispersada de una solución de sulfato de poliestireno sódico (NaPSS; PM 400.000; 4 mg/ml en NaCl 10 mM). La función de correlación oscilante que se muestra en la Fig. 4a es el resultado de la interferencia entre la luz dispersada y la luz de referencia modulada. El latido de la Fig. 4b incluye además la contribución de los cambios de frecuencia de la luz dispersada por las moléculas de PSS bajo un campo eléctrico de 40 V/cm.

La Figura 5 muestra espectros de potencia heterodina obtenidos mediante la transformada de Fourier de las funciones de autocorrelación que se muestran en la Fig. 4.

La Figura 6 muestra gráficos de frecuencias de desplazamiento Doppler medidas a diferentes profundidades de celda e intensidades de campo eléctrico, donde una muestra es la solución NaPSS. Estas curvas parabólicas se denominan perfiles de flujo electroosmótico e indican que la velocidad de las partículas cambió a diferentes profundidades. El potencial superficial de la pared celular produce un flujo electroosmótico. Dado que la cámara de electroforesis es un sistema cerrado, el flujo de retorno se produce en el centro de la celda. Entonces la movilidad o velocidad observada de la ecuación. (7) es el resultado de la combinación de flujo osmótico y movimiento electroforético.

Mori y Okamoto [16] estudiaron el análisis de la movilidad electroforética y tuvieron en cuenta el efecto del flujo electroosmótico en la pared lateral.

El perfil de velocidad o movilidad en el centro de la celda viene dado aproximadamente por la ecuación. (11) para el caso donde k>5.

${\displaystyle \ U_{a}(z)=AU_{0}(z/b)^{2}+\Delta U_{0}(z/b)+(1-A)U_{0}+U_{p}\qquad (11)}$

dónde

${\displaystyle \ z=\,}$ profundidad de la celda

${\displaystyle \ U_{a}(z)=\,}$ Velocidad electroforética aparente de la partícula en la posición z.

${\displaystyle \ U_{p}=\,}$ verdadera velocidad electroforética de las partículas.

${\displaystyle \ z/b=\,}$espesor de la celda

${\displaystyle \ U_{0}=\,}$Velocidad promedio del flujo osmótico en la pared celular superior e inferior.

${\displaystyle \Delta U_{0}=\,}$diferencia entre velocidades del flujo osmótico en la pared celular superior e inferior.

${\displaystyle \ A={\frac {1}{(2/3)-(0.420166/k)}}\qquad (12)}$

${\displaystyle \ k=a/b\,}$, una relación entre las longitudes de dos lados de la sección transversal rectangular.

La curva parabólica del cambio de frecuencia causado por el flujo electroosmótico que se muestra en la Fig. 6 encaja con la ecuación. (11) con aplicación del método de mínimos cuadrados.

Dado que la movilidad es proporcional a un cambio de frecuencia de la luz dispersada por una partícula y la velocidad de migración de una partícula como lo indica la ecuación. (7), todos los cambios de velocidad, movilidad y frecuencia se expresan mediante ecuaciones parabólicas. Entonces se obtiene la verdadera movilidad electroforética de una partícula, la movilidad electroosmótica en las paredes superior e inferior de la célula. El cambio de frecuencia causado únicamente por la electroforesis de partículas es igual a la movilidad aparente en la capa estacionaria.

La velocidad de la migración electroforética así obtenida es proporcional al campo eléctrico como se muestra en la Fig. 7. El cambio de frecuencia aumenta con el aumento del ángulo de dispersión como se muestra en la Fig. 8. Este resultado está de acuerdo con la ecuación teórica. (7).

• 
  Figuras 4 a y b; Función de correlación con y sin campo eléctrico. Muestra: Solución de NaPSS (PM: 400.000) de 4 mg/ml en NaCl 10 mM. Campo eléctrico aplicado: (a) 0 V/cm; (b) 40 V/cm. Ángulo de dispersión 7,0 grados, temperatura 25 +-0,3
• 
  Fig. 5. Espectros de potencia heterodina obtenidos mediante FFT de las funciones de correlación.
• 
  Fig. 6. Cambios de frecuencia observados en varias profundidades de celda.
• 
  Fig. 7. Dependencia del campo eléctrico de la velocidad en la capa estacionaria.
• 
  Fig. 8. Cambio de frecuencia en función del ángulo de dispersión.

Aplicaciones

La dispersión de luz electroforética (ELS) se utiliza principalmente para caracterizar las cargas superficiales de partículas coloidales como macromoléculas o polímeros sintéticos (por ejemplo, poliestireno ^[6] ) en medios líquidos en un campo eléctrico. Además de información sobre cargas superficiales, ELS también puede medir el tamaño de partículas de proteínas ^[7] y determinar la distribución del potencial zeta .

Biofísica

ELS es útil para caracterizar información sobre la superficie de proteínas. Ware y Flygare (1971) demostraron que las técnicas electroforéticas se pueden combinar con la espectroscopía láser para determinar simultáneamente la movilidad electroforética y el coeficiente de difusión de la albúmina sérica bovina . ^[8] El ancho de un espectro de luz desplazado Doppler que se dispersa desde una solución de macromoléculas es proporcional al coeficiente de difusión . ^[9] El desplazamiento Doppler es proporcional a la movilidad electroforética de una macromolécula. ^[10] A partir de estudios que han aplicado este método a la poli (L-lisina) , se cree que ELS monitorea las movilidades de fluctuación en presencia de solventes con diferentes concentraciones de sal. ^[11] También se ha demostrado que los datos de movilidad electroforética se pueden convertir a valores de potencial zeta , lo que permite la determinación del punto isoeléctrico de las proteínas y el número de cargas electrocinéticas en la superficie. ^[12]

Otras macromoléculas biológicas que se pueden analizar con ELS incluyen los polisacáridos . Los valores de pKa de los quitosanos se pueden calcular a partir de la dependencia de los valores de movilidad electroforética del pH y la densidad de carga. ^[13] Al igual que las proteínas, el tamaño y el potencial zeta de los quitosanos se pueden determinar mediante ELS. ^[14]

ELS también se ha aplicado a ácidos nucleicos y virus. La técnica se puede ampliar para medir la movilidad electroforética de moléculas de bacterias grandes con fuerzas iónicas bajas. ^[15]

Nanopartículas

ELS se ha utilizado para caracterizar la polidispersidad , nanodispersidad y estabilidad de nanotubos de carbono de pared simple en un ambiente acuoso con tensioactivos. ^{[ cita necesaria ]} La técnica se puede utilizar en combinación con la dispersión dinámica de la luz para medir estas propiedades de los nanotubos en muchos disolventes diferentes.

Referencias

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2. Josefowicz, J.; Hallett, Francia (1 de marzo de 1975). "Dispersión de luz electroforética homodina de esferas de poliestireno mediante correlación de intensidad de haz transversal láser". Óptica Aplicada . 14 (3). La Sociedad Óptica: 740. doi :10.1364/ao.14.000740. ISSN  0003-6935.
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