La PCR de inicio en caliente es una forma modificada de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional que reduce la presencia de productos no deseados y dímeros de cebadores debido a la amplificación de ADN no específica a temperaturas ambiente (o más frías). [1] [2] Se han desarrollado muchas variaciones y modificaciones del procedimiento de PCR para lograr mayores rendimientos; la PCR de inicio en caliente es una de ellas. [3] La PCR de inicio en caliente sigue los mismos principios que la PCR convencional, en el sentido de que utiliza la ADN polimerasa para sintetizar ADN a partir de una plantilla monocatenaria. [4] Sin embargo, utiliza métodos de calentamiento y separación adicionales, como la inactivación o inhibición de la unión de la Taq polimerasa y la adición tardía de la Taq polimerasa, para aumentar el rendimiento del producto y proporcionar una mayor especificidad y sensibilidad. [5] La unión no específica y el cebado o la formación de dímeros de cebadores se minimizan completando la mezcla de reacción después de la desnaturalización . [6] Algunas formas de completar mezclas de reacción a altas temperaturas implican modificaciones que bloquean la actividad de la ADN polimerasa a bajas temperaturas, [1] [7] el uso de desoxirribonucleótidos trifosfatos (dNTP) modificados, [8] y la adición física de uno de los reactivos esenciales después de la desnaturalización. [9]
Mediante estos métodos adicionales, la PCR de inicio en caliente puede reducir la cantidad de amplificaciones no específicas que ocurren naturalmente durante temperaturas más bajas, lo que sigue siendo un problema para la PCR convencional. Estas modificaciones funcionan en general para garantizar que las enzimas específicas en solución permanezcan inactivas o se inhiban hasta que se alcance la temperatura de hibridación óptima. [10] La inhibición de la formación de productos de PCR no específicos, especialmente en los primeros ciclos, da como resultado un aumento sustancial en la sensibilidad de la amplificación por PCR. Esto es de suma importancia en aplicaciones de diagnóstico de PCR o RT-PCR.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología molecular que se utiliza para amplificar segmentos específicos de ADN en varios órdenes de magnitud. Los segmentos específicos de ADN se amplifican mediante tres procesos: desnaturalización, hibridación y extensión, en los que las cadenas de ADN se separan elevando la temperatura a la temperatura ambiente óptima antes de que los cebadores se unan y la polimerasa alinee los nucleótidos con la cadena molde. Utiliza la ADN polimerasa , que es ligeramente activa a bajas temperaturas. [1] En la PCR convencional, la mezcla de reacción se completa a temperatura ambiente y, debido a la actividad de la ADN polimerasa, los cebadores pueden formar dímeros de cebadores o hibridarse con el ADN de forma no específica. Durante el procedimiento de PCR, la ADN polimerasa extenderá cualquier fragmento de ADN con cebadores unidos, generando productos objetivo pero también productos no específicos que reducen el rendimiento. En la PCR de inicio en caliente, algunos de los reactivos se mantienen separados hasta que la mezcla se calienta a la temperatura de hibridación específica. Esto reduce el tiempo de hibridación, lo que a su vez reduce la probabilidad de extensión no específica del ADN y la influencia de la unión de cebadores no específicos antes de la desnaturalización. [6] [5]
En la PCR convencional, las temperaturas inferiores a la temperatura óptima de hibridación (50-65 °C) dan como resultado modificaciones fuera del objetivo, como amplificaciones no específicas en las que los cebadores se unirán de forma no específica al ácido nucleico. [5] Estos complejos de cebadores no específicos, que se encuentran en exceso en la mezcla, son la causa de la síntesis de subproductos, como el dímero de cebador y el cebado incorrecto. [10] El cebado incorrecto impide y reduce en gran medida la eficiencia de la amplificación por PCR al competir activamente con las secuencias objetivo para la amplificación. De manera similar, los dímeros de cebadores forman complejos que disminuyen la cantidad de amplificaciones del número de copias obtenidas. [10] Esto se puede controlar implementando la PCR de inicio en caliente que permite bloquear las extensiones de cebador hasta que se alcancen las temperaturas óptimas. [2]
En la PCR de inicio en caliente, se evita que los reactivos importantes (como la ADN polimerasa y los cofactores de magnesio) reaccionen en la mezcla de PCR hasta que se alcancen las temperaturas óptimas mediante separación física o modificaciones químicas. [5] [2] La PCR de inicio en caliente también puede ocurrir cuando la polimerasa Taq se inhibe/inactiva o su adición se retrasa hasta las temperaturas de hibridación óptimas, a través de modificaciones de trifosfato de desoxirribonucleótido o modificando los cebadores a través de enjaulado y manipulación de la estructura secundaria .
La PCR de inicio en caliente suele ser un mejor enfoque en comparación con la PCR tradicional en circunstancias en las que hay una baja concentración de ADN en la mezcla de reacción, la plantilla de ADN es muy compleja o si hay varios pares de cebadores de oligonucleótidos en la PCR. [3]
La PCR de inicio en caliente es un método que evita la extensión de la ADN polimerasa a una temperatura más baja para evitar la unión no específica y minimizar la pérdida de rendimiento. La PCR de inicio en caliente reduce la cantidad de unión no específica mediante la limitación de reactivos hasta los pasos de calentamiento de la PCR; limite la reacción temprana al limitar la ADN polimerasa Taq en una reacción. La unión no específica a menudo conduce a dímeros de cebadores y objetivos mal cebados o con cebadores falsos. [11] Estos pueden rectificarse mediante métodos modificados como:
Anticuerpos ligados a enzimas/ADN polimerasa Taq en complejo con anticuerpos anti-ADN polimerasa Taq:
Los anticuerpos unidos a enzimas inactivan la ADN polimerasa Taq. Los anticuerpos se unen a la polimerasa y se unen a ella, lo que impide la amplificación temprana del ADN que podría producirse a temperaturas más bajas. Una vez que se alcanza la temperatura de hibridación óptima, los anticuerpos comenzarán a degradarse y disociarse, liberando la ADN polimerasa Taq en la reacción y permitiendo que comience el proceso de amplificación. [2] [12] La ADN polimerasa Taq Platinum y la ADN polimerasa Taq AccuStart (ambas desarrolladas por Ayoub Rashtchian en Life Technologies y Quanta BioSciences, respectivamente) son ejemplos de ADN polimerasas Taq de inicio en caliente basadas en anticuerpos disponibles comercialmente. Estas ADN polimerasas Taq están precomplejadas con una mezcla de anticuerpos monoclonales específicos para la ADN polimerasa Taq. [13]
Perlas de cera:
Las perlas de cera, que dependen de la temperatura, crean una barrera física entre la ADN polimerasa Taq y el resto de los componentes de la PCR. Una vez que la temperatura supera los 70 °C, durante el paso de desnaturalización del primer ciclo, las perlas de cera se derriten, lo que permite que la ADN polimerasa Taq escape más allá de la barrera y se libere en la reacción, lo que da inicio al proceso de amplificación. Luego, la capa de cera se mueve hacia la parte superior de la mezcla de reacción durante la etapa de amplificación para luego actuar como barrera de vapor. [2]
Oligonucleótidos altamente específicos:
Los oligonucleótidos son polímeros cortos de ácido nucleico que se unen fácilmente. Los oligonucleótidos altamente específicos, como los aptámeros, se unen a la ADN polimerasa Taq a temperaturas más bajas, lo que la hace inactiva en la mezcla. Solo a temperaturas más altas los oligonucleótidos se separarán de la Taq, lo que le permitirá reaccionar. [5]
Estos son los métodos más eficaces para la PCR de inicio en caliente; los anticuerpos ligados a enzimas y los métodos de oligonucleótidos altamente específicos en particular son los más adecuados durante los procedimientos que requieren un tiempo de inactivación más corto. [14] Sin embargo, se sabe que se pueden implementar otros métodos, como:
Precalentamiento:
La máquina PCR se calienta con antelación mientras se mezclan los componentes sobre hielo y luego se coloca inmediatamente en la máquina PCR una vez que alcanza la temperatura óptima. Esto eliminaría el proceso de calentamiento necesario, reduciría la hibridación no específica de los cebadores y garantizaría que cualquier cebador que no se aparee correctamente en la mezcla se separe. [15]
Congelación:
La congelación actúa como una forma de separación física, de forma muy similar a las perlas de cera. La mezcla de reacción que contiene los cebadores, la cadena molde, el agua y el desoxirribonucleótido trifosfato (dNTP) se congela antes de que la polimerasa Taq y los componentes restantes de la PCR se añadan sobre la mezcla congelada. Esto actúa para evitar la unión no específica. [15]
Adición posterior de Taq:
Los componentes de la PCR en la mezcla de reacción se preparan y calientan sin la adición de Taq. La Taq solo se introduce en la mezcla más tarde, una vez que se alcanza la temperatura óptima. Sin embargo, este método es el menos confiable y puede provocar una contaminación de los componentes. [15]
Otro método es mediante PCR de inicio en caliente mediada por desoxirribonucleótido trifosfato, que modifica las bases de los nucleótidos a través de un grupo protector.
El dNTP de inicio en caliente se puede modificar químicamente para incluir un grupo protector sensible al calor en el extremo 3 del cebador. Esta modificación evitará que los nucleótidos interactúen con la polimerasa Taq para unirse a la cadena de plantilla hasta que se alcancen las temperaturas óptimas, por lo tanto, el grupo protector se eliminará durante el paso de activación por calor. El dNTP de inicio en caliente, dA, dT, dC y dG reemplazan a los nucleótidos naturales. [16] [17] Se recomienda utilizar los cuatro nucleótidos modificados, sin embargo, investigaciones anteriores muestran que reemplazar uno o dos de los nucleótidos naturales con los dNTP modificados sería suficiente para garantizar que no se produzca una amplificación no específica. [16] [17] Otra modificación química del ácido nucleico es a través de la modificación covalente reversible por calor que actúa para impedir la hibridación de los cebadores con la plantilla de interés. El grupo amino de la guanosina interactúa con el glioxal para formar dG. [18]
Estructura secundaria:
Ciertas estructuras secundarias pueden impedir las funciones de los cebadores. Por ejemplo, los oligonucleótidos con una estructura de horquilla no pueden actuar eficazmente como cebadores. Sin embargo, después de calentar la mezcla de reacción a la temperatura de hibridación, el cebador experimentará un cambio de conformación que le permitirá formar una estructura lineal, lo que le permite unirse al segmento objetivo y comenzar la PCR. [19] [20] En realidad, existe una configuración más estable para los cebadores de horquilla denominados cebadores de "doble burbuja", que forman una configuración de homodímero de cabeza a cola que se puede utilizar tanto para la transcripción inversa como para la PCR de inicio en caliente. [21]
Jaulas extraíbles fotoquímicamente:
Un grupo de enjaulamiento, que es un grupo protector que se puede eliminar fotoquímicamente, como las fosforamiditas de timidina enjauladas, se incorpora a un cebador de oligonucleótidos. Esto permite que la función del cebador se active y desactive mediante el uso de radiación UV (365 nm). Por lo tanto, los cebadores se pueden activar después de que se alcanza la temperatura de hibridación. [22]
El magnesio es necesario en la PCR y actúa como cofactor porque la polimerasa Taq depende del magnesio. [23] Aumentar la concentración de magnesio y fosfato en los reactivos de tampón estándar crea un precipitado de magnesio , lo que proporciona un inicio rápido para la reacción, ya que no hay magnesio para la ADN polimerasa hasta la etapa de ciclado térmico. Durante el ciclado térmico, el magnesio se disolverá nuevamente en solución y estará disponible para que la polimerasa lo use, lo que le permitirá funcionar normalmente. [24]
La PCR de inicio en caliente es ventajosa porque requiere menos manipulación y reduce el riesgo de contaminación. La PCR de inicio en caliente puede ser modificada químicamente o basada en anticuerpos, lo que proporciona diferentes ventajas al procedimiento. En la PCR de inicio en caliente modificada químicamente, el procedimiento puede realizarse a temperatura ambiente y disminuye significativamente la formación de dímeros de cebadores al evitar que los cebadores se unan entre sí antes de que haya comenzado el proceso de PCR, así como al limitar el cebado no específico. De manera similar, la PCR de inicio en caliente inhibe la unión de los cebadores a las secuencias de plantilla que tienen una homología baja, lo que conduce a un cebado incorrecto. También puede mejorar la especificidad y la sensibilidad, debido a las condiciones estrictas, así como aumentar el rendimiento del producto del fragmento objetivo. [5] En la PCR de inicio en caliente basada en anticuerpos, la polimerasa se activa después del paso de desnaturalización inicial durante el proceso de ciclado, lo que disminuye el tiempo requerido. Esto también conduce a una alta especificidad . [14]
Junto con sus ventajas, la PCR de inicio en caliente también tiene limitaciones que deben considerarse antes de implementar el método. La PCR de inicio en caliente requiere la adición de calor durante períodos de tiempo más largos en comparación con la PCR convencional, por lo tanto, el ADN molde es más susceptible a dañarse. El mayor tiempo de calentamiento también significa que el procedimiento no es compatible con ciertos procedimientos, como el método de PCR de transcripción inversa de un solo tubo y tampón, que requiere una temperatura más baja para realizar el paso de transcripción inversa. [12] En la PCR de inicio en caliente modificada químicamente, el proceso de amplificación del ADN puede verse afectado negativamente, en primer lugar, debido a un aumento significativo en el tiempo de reactivación necesario para que la polimerasa se active y, en segundo lugar, si la longitud de la plantilla de ADN objetivo es demasiado larga. [14] En los procedimientos basados en anticuerpos, cada enzima requiere un anticuerpo diferente y, por lo tanto, el costo para realizar el procedimiento es mayor. [15] También existe evidencia de que muchas enzimas de inicio en caliente comerciales en realidad tienen cierto nivel de actividad antes de la desnaturalización, y pocos proveedores proporcionan información sobre las pruebas de esta actividad residual. [25] Esto significa que los beneficios atribuidos a las enzimas de inicio en caliente pueden no materializarse o, en el mejor de los casos, variarán entre lotes o fabricantes.
