La resonancia paramagnética electrónica pulsada (EPR) es una técnica de resonancia paramagnética electrónica que implica la alineación del vector de magnetización neta de los espines de los electrones en un campo magnético constante . Esta alineación se altera aplicando un campo oscilante corto, normalmente un pulso de microondas. A continuación, se puede medir la señal de microondas emitida que se crea mediante la magnetización de la muestra. La transformación de Fourier de la señal de microondas produce un espectro EPR en el dominio de la frecuencia. Con una amplia variedad de secuencias de pulsos, es posible obtener un amplio conocimiento sobre las propiedades estructurales y dinámicas de los compuestos paramagnéticos. Las técnicas de EPR pulsada, como la modulación de la envolvente del eco del espín electrónico (ESEEM) o la resonancia nuclear doble de electrones pulsada (ENDOR), pueden revelar las interacciones del espín electrónico con los espines nucleares que lo rodean .
La resonancia paramagnética electrónica (EPR) o resonancia de espín electrónico (ESR) es una técnica espectroscópica ampliamente utilizada en biología, química, medicina y física para estudiar sistemas con uno o más electrones desapareados. Debido a la relación específica entre los parámetros magnéticos, la función de onda electrónica y la configuración de los núcleos circundantes de espín distinto de cero, la EPR y la ENDOR proporcionan información sobre la estructura, la dinámica y la distribución espacial de las especies paramagnéticas. Sin embargo, estas técnicas están limitadas en resolución espectral y temporal cuando se utilizan con métodos tradicionales de onda continua. Esta resolución se puede mejorar en la EPR pulsada investigando las interacciones por separado a través de secuencias de pulsos.
RJ Blume informó del primer eco de espín electrónico en 1958, que provino de una solución de sodio en amoníaco en su punto de ebullición, -33,8˚C. [1] Se utilizó un campo magnético de 0,62 mT que requería una frecuencia de 17,4 MHz. Los primeros ecos de espín electrónico de microondas fueron informados en el mismo año por Gordon y Bowers utilizando una excitación de 23 GHz de dopantes en silicio . [2]
Gran parte de la primera y pionera técnica de EPR pulsada se llevó a cabo en el grupo de WB Mims en Bell Labs durante la década de 1960. En la primera década, solo un pequeño número de grupos trabajaron en este campo, debido a la costosa instrumentación, la falta de componentes de microondas adecuados y la lentitud de la electrónica digital. La primera observación de la modulación de la envolvente del eco del espín electrónico (ESEEM) fue realizada en 1961 por Mims, Nassau y McGee. [3] La doble resonancia nuclear electrónica pulsada (ENDOR) fue inventada en 1965 por Mims. [4] En este experimento, las transiciones de RMN pulsadas se detectan con EPR pulsada. La ESEEM y la ENDOR pulsada siguen siendo importantes para estudiar los espines nucleares acoplados a los espines electrónicos.
En la década de 1980, la aparición de los primeros espectrómetros comerciales de pulsos EPR y ENDOR en el rango de frecuencias de banda X condujo a un rápido crecimiento del campo. En la década de 1990, en paralelo con la aparición de los EPR de alto campo, los pulsos EPR y ENDOR se convirtieron en una nueva herramienta de espectroscopia de resonancia magnética de rápido avance y apareció en el mercado el primer espectrómetro comercial de pulsos EPR y ENDOR en frecuencias de banda W.
El principio básico de la EPR pulsada y la RMN es similar. Se pueden encontrar diferencias en el tamaño relativo de las interacciones magnéticas y en las tasas de relajación que son órdenes de magnitudes mayores (más rápidas) en la EPR que en la RMN. Se proporciona una descripción completa de la teoría dentro del formalismo mecánico cuántico, pero dado que la magnetización se mide como una propiedad global, se puede obtener una imagen más intuitiva con una descripción clásica. Para una mejor comprensión del concepto de EPR pulsada, considere los efectos sobre el vector de magnetización en el marco de referencia del laboratorio , así como en el marco de referencia giratorio . Como muestra la animación a continuación, en el marco de referencia del laboratorio se supone que el campo magnético estático B 0 es paralelo al eje z y el campo de microondas B 1 paralelo al eje x. Cuando un espín de electrón se coloca en un campo magnético, experimenta un par que hace que su momento magnético precese alrededor del campo magnético. La frecuencia de precesión se conoce como frecuencia de Larmor ω L . [5]
donde γ es la relación giromagnética y B 0 el campo magnético. Los espines de los electrones se caracterizan por dos estados mecánicos cuánticos, uno paralelo y otro antiparalelo a B 0 . Debido a la menor energía del estado paralelo, se pueden encontrar más espines de electrones en este estado de acuerdo con la distribución de Boltzmann . Esta población desequilibrada da como resultado una magnetización neta, que es la suma vectorial de todos los momentos magnéticos en la muestra, paralela al eje z y al campo magnético. Para comprender mejor los efectos del campo de microondas B 1 es más fácil pasar al marco giratorio.
Los experimentos de EPR suelen utilizar un resonador de microondas diseñado para crear un campo de microondas polarizado linealmente B 1 , perpendicular al campo magnético aplicado, mucho más fuerte, B 0 . El marco giratorio está fijado a los componentes giratorios B 1 . Primero, suponemos que está en resonancia con el vector de magnetización en precesión M 0 .
Por lo tanto, el componente de B 1 parecerá estacionario. En este marco, los componentes de magnetización en precesión también parecen ser estacionarios, lo que conduce a la desaparición de B 0 , y solo necesitamos considerar B 1 y M 0 . El vector M 0 está bajo la influencia del campo estacionario B 1 , lo que conduce a otra precesión de M 0 , esta vez alrededor de B 1 a la frecuencia ω 1 .
Esta frecuencia angular ω 1 también se denomina frecuencia de Rabi . Suponiendo que B 1 es paralelo al eje x, el vector de magnetización rotará alrededor del eje +x en el plano zy mientras se apliquen las microondas. El ángulo en el que M 0 rota se denomina ángulo de punta α y se expresa mediante:
Aquí t p es la duración durante la cual se aplica B 1 , también llamada longitud del pulso. Los pulsos están etiquetados por la rotación de M 0 que causan y la dirección desde la que provienen, ya que las microondas pueden desplazarse en fase del eje x al eje y. Por ejemplo, un pulso +y π/2 significa que un campo B 1 , que ha sido desplazado en fase 90 grados desde la dirección +x hacia la dirección +y, ha rotado M 0 en un ángulo de punta de π/2, por lo tanto, la magnetización terminaría a lo largo del eje –x. Eso significa que la posición final del vector de magnetización M 0 depende de la longitud, la magnitud y la dirección del pulso de microondas B 1 . Para entender cómo la muestra emite microondas después del intenso pulso de microondas, necesitamos volver al marco de referencia del laboratorio. En el marco de referencia giratorio y en resonancia, la magnetización parecía estar estacionaria a lo largo del eje x o y después del pulso. En el marco de laboratorio, se convierte en una magnetización rotatoria en el plano xy a la frecuencia de Larmor. Esta rotación genera una señal que se maximiza si el vector de magnetización está exactamente en el plano xy. Esta señal de microondas generada por el vector de magnetización rotatoria se denomina decaimiento por inducción libre (FID). [6]
Otra suposición que hemos hecho es la condición de resonancia exacta, en la que la frecuencia de Larmor es igual a la frecuencia de microondas. En realidad, los espectros EPR tienen muchas frecuencias diferentes y no todas pueden estar exactamente en resonancia, por lo tanto, debemos tener en cuenta los efectos fuera de resonancia. Los efectos fuera de resonancia conducen a tres consecuencias principales. La primera consecuencia se puede entender mejor en el marco giratorio. Un pulso π/2 deja magnetización en el plano xy, pero como el campo de microondas (y, por lo tanto, el marco giratorio) no tienen la misma frecuencia que el vector de magnetización en precesión, el vector de magnetización gira en el plano xy, ya sea más rápido o más lento que el campo magnético de microondas B 1 . La velocidad de rotación está gobernada por la diferencia de frecuencia Δω.
Si Δω es 0, entonces el campo de microondas gira tan rápido como el vector de magnetización y ambos parecen estar estacionarios entre sí. Si Δω>0, entonces la magnetización gira más rápido que el componente del campo de microondas en un movimiento en sentido antihorario y si Δω<0, entonces la magnetización es más lenta y gira en el sentido de las agujas del reloj. Esto significa que los componentes de frecuencia individuales del espectro EPR aparecerán como componentes de magnetización que giran en el plano xy con la frecuencia de rotación Δω. La segunda consecuencia aparece en el marco de laboratorio. Aquí B 1 inclina la magnetización de forma diferente fuera del eje z, ya que B 0 no desaparece cuando no está en resonancia debido a la precesión del vector de magnetización en Δω. Eso significa que la magnetización ahora está inclinada por un campo magnético efectivo B eff , que se origina a partir de la suma vectorial de B 1 y B 0 . La magnetización se inclina entonces alrededor de B eff a una tasa efectiva más rápida ω eff .
Esto nos lleva directamente a la tercera consecuencia: la magnetización no se puede inclinar de manera eficiente hacia el plano xy porque B eff no se encuentra en el plano xy, como sí lo hace B 1. El movimiento de la magnetización ahora define un cono. Esto significa que, a medida que Δω se hace más grande, la magnetización se inclina de manera menos efectiva hacia el plano xy y la señal FID disminuye. En espectros EPR amplios donde Δω > ω 1, no es posible inclinar toda la magnetización hacia el plano xy para generar una señal FID fuerte. Por eso es importante maximizar ω 1 o minimizar la longitud del pulso π/2 para señales EPR amplias.
Hasta ahora, la magnetización se inclinó hacia el plano xy y permaneció allí con la misma magnitud. Sin embargo, en realidad, los espines de los electrones interactúan con sus alrededores y la magnetización en el plano xy decaerá y eventualmente volverá a alinearse con el eje z. Este proceso de relajación se describe mediante el tiempo de relajación espín-red T 1 , que es un tiempo característico que necesita la magnetización para volver al eje z, y mediante el tiempo de relajación espín-espín T 2 , que describe el tiempo de desaparición de la magnetización en el plano xy. La relajación espín-red resulta de la urgencia del sistema de volver al equilibrio térmico después de haber sido perturbado por el pulso B 1 . El retorno de la magnetización paralela a B 0 se logra a través de interacciones con los alrededores, es decir, la relajación espín-red. El tiempo de relajación correspondiente debe considerarse al extraer una señal del ruido, donde el experimento debe repetirse varias veces, lo más rápido posible. Para repetir el experimento es necesario esperar hasta que la magnetización a lo largo del eje z se haya recuperado, porque si no hay magnetización en la dirección z, entonces no hay nada que se incline hacia el plano xy para crear una señal significativa.
El tiempo de relajación espín-espín, también llamado tiempo de relajación transversal, está relacionado con el ensanchamiento homogéneo y no homogéneo. Un ensanchamiento no homogéneo resulta del hecho de que los diferentes espines experimentan inhomogeneidades del campo magnético local (entornos diferentes) creando una gran cantidad de paquetes de espines caracterizados por una distribución de Δω. A medida que el vector de magnetización neta precesa, algunos paquetes de espines se desaceleran debido a campos más bajos y otros se aceleran debido a campos más altos, lo que lleva a una expansión en abanico del vector de magnetización que da como resultado la descomposición de la señal EPR. Los otros paquetes contribuyen a la descomposición de la magnetización transversal debido al ensanchamiento homogéneo. En este proceso, todos los espines en un paquete de espines experimentan el mismo campo magnético e interactúan entre sí, lo que puede llevar a cambios de espines mutuos y aleatorios. Estas fluctuaciones contribuyen a una expansión en abanico más rápida del vector de magnetización.
Toda la información sobre el espectro de frecuencias está codificada en el movimiento de la magnetización transversal. El espectro de frecuencias se reconstruye utilizando el comportamiento temporal de la magnetización transversal formada por los componentes de los ejes y y x. Es conveniente que estos dos puedan tratarse como los componentes reales e imaginarios de una cantidad compleja y utilizar la teoría de Fourier para transformar la señal medida en el dominio del tiempo en la representación del dominio de la frecuencia. Esto es posible porque se detectan tanto las señales de absorción (reales) como las de dispersión (imaginarias).
La señal FID se desintegra y, en el caso de espectros EPR muy amplios, esta desintegración es bastante rápida debido al ensanchamiento no homogéneo. Para obtener más información, se puede recuperar la señal desaparecida con otro pulso de microondas para producir un eco de Hahn . [7] Después de aplicar un pulso π/2 (90°), el vector de magnetización se inclina hacia el plano xy produciendo una señal FID. Las diferentes frecuencias en el espectro EPR (ensanchamiento no homogéneo) hacen que esta señal se "despliegue", lo que significa que los paquetes de espín más lentos se quedan atrás de los más rápidos. Después de un cierto tiempo t , se aplica un pulso π (180°) al sistema invirtiendo la magnetización, y los paquetes de espín rápidos quedan entonces detrás, alcanzando a los paquetes de espín lentos. En ese momento, se produce un reenfoque completo de la señal en el tiempo 2t . Un eco preciso causado por un segundo pulso de microondas puede eliminar todos los efectos de ensanchamiento no homogéneo. Después de que todos los paquetes de espín se amontonen, se desfasarán de nuevo como un FID. En otras palabras, un eco de espín es un FID invertido seguido de un FID normal, que puede transformarse en Fourier para obtener el espectro EPR. Cuanto más largo sea el tiempo entre los pulsos, más pequeño será el eco debido a la relajación del espín. Cuando esta relajación conduce a una disminución exponencial en la altura del eco, la constante de disminución es el tiempo de memoria de fase T M , que puede tener muchas contribuciones, como la relajación transversal, la difusión espectral, de espín e instantánea. Cambiar los tiempos entre los pulsos conduce a una medición directa de T M como se muestra en la animación de disminución del eco de espín a continuación.
ESEEM [3] [5] y ENDOR pulsado [4] [5] son experimentos de eco ampliamente utilizados , en los que se puede estudiar y controlar la interacción de los espines de los electrones con los núcleos en su entorno.
Un experimento popular de EPR pulsado en la actualidad es la resonancia doble electrón-electrón (DEER), también conocida como resonancia doble electrón-electrón pulsada (PELDOR). [5] En este experimento, dos frecuencias controlan dos espines para investigar su acoplamiento. La distancia entre los espines se puede inferir a partir de su fuerza de acoplamiento. Esta información se utiliza para dilucidar las estructuras de grandes biomoléculas. La espectroscopia PELDOR es una herramienta versátil para las investigaciones estructurales de las proteínas, incluso en un entorno celular. [8]
