La interferometría de biocapa ( BLI ) es una tecnología de biodetección óptica que analiza las interacciones biomoleculares en tiempo real sin necesidad de etiquetado fluorescente. [1] Junto con la resonancia de plasmón superficial , la BLI es una de las pocas tecnologías de biodetección sin etiquetas ampliamente disponibles , un estilo de detección que brinda más información en menos tiempo que los procesos tradicionales. [2] La tecnología se basa en la correlación de longitud de onda de cambio de fase creada entre patrones de interferencia de dos superficies únicas en la punta de un biosensor. [3] La BLI tiene aplicaciones significativas en la cuantificación de la fuerza de unión, la medición de interacciones de proteínas y la identificación de propiedades de la cinética de reacción, como las constantes de velocidad y las velocidades de reacción. [4]
La interferometría de biocapa mide la cinética y las interacciones biomoleculares en base a la interferencia de ondas . Para preparar el análisis BLI entre dos biomoléculas únicas, primero se inmoviliza el ligando sobre un biosensor biocompatible mientras el analito está en solución. [5] Poco después de esto, la punta del biosensor se sumerge en la solución y la molécula objetivo comenzará a asociarse con el analito, produciendo una capa sobre la punta del biosensor. Esto crea dos superficies separadas: el sustrato en sí y el sustrato que interactúa con la molécula inmovilizada en la punta del biosensor. [1] Esto crea esencialmente una interferencia de película delgada , en la que la capa creada actúa como una película delgada unida por estas dos superficies. La luz blanca de una lámpara de tungsteno se proyecta sobre la punta del biosensor y se refleja en ambas superficies, creando dos patrones de reflexión únicos con diferentes intensidades . [5] La Figura 2 expresa este fenómeno en una forma más general. El cambio de longitud de onda (Δλ) entre estos dos patrones de reflexión crea un patrón de interferencia (Figura 3) a partir del cual se pueden obtener todos los resultados deseados. [1] Dado que el cambio de longitud de onda es una medida directa del cambio en el espesor de la capa biológica y el espesor de la capa biológica cambiará en respuesta a las moléculas que se asocian y se disocian del biosensor, el patrón de interferencia permitirá el monitoreo en tiempo real de las interacciones moleculares en la superficie del biosensor. [6] En resumen, un cambio de longitud de onda positivo implica un aumento en el espesor de la biocapa y, por lo tanto, más asociación, mientras que un cambio de longitud de onda negativo implica una disminución en el espesor de la biocapa y, por lo tanto, más disociación. [6]
Las plataformas de interferometría de biocapas logran un alto rendimiento al utilizar un formato de "inmersión y lectura". [1] Las puntas del biosensor se transportan directamente a la muestra deseada y se "inmergen" en su compartimento respectivo, lo que elimina la necesidad de microfluidos y las complicaciones (obstrucción, purificación) que conlleva. [1] [7] Esta estructura suele estar soportada por un robot, y para lograrlo se combinan formatos de placa de 96 y 384 pocillos. [8] Este método de detección distintivo garantiza que la concentración y la viscosidad de la muestra y los índices de refracción variables rara vez afecten los resultados de BLI. [1] Por lo tanto, BLI encuentra un uso significativo en medios viscosos como el glicerol, donde otras técnicas pueden tener dificultades. [9]
La interferometría de biocapa se basa en biosensores con una punta de fibra óptica sobre la que se inmoviliza el ligando. [1] La punta está recubierta además con una matriz biocompatible con la molécula objetivo para limitar cualquier unión no específica. Para que los cálculos de BLI funcionen, es necesario suponer que tanto la punta de fibra óptica como el ligando y el analito unidos actúan como superficies delgadas y reflectantes. [10] Los biosensores son desechables, lo que da como resultado bajos costos y alta disponibilidad comercial. [11] La selección del biosensor está determinada por los resultados de prueba deseados: análisis cinético, análisis cuantitativo o ambos. [12] La mayoría de los tipos de biosensores disponibles comercialmente se agruparán en una de estas tres categorías por el fabricante de BLI. [1]
Un uso clave de la interferometría de biocapa es analizar y cuantificar las interacciones entre conjuntos de biomoléculas. [1] Esto es extremadamente útil en la investigación farmacéutica, en la que la interacción biomolécula-membrana determina las características de un fármaco determinado. Debido a su capacidad para lograr datos de alta resolución y alto rendimiento, la BLI se ha utilizado para identificar propiedades biofísicas de bicapas lipídicas, lo que permite un método de estudio alternativo a los métodos in vitro tradicionales que se utilizan actualmente ( microscopía , electroforesis ). [6] Además, la BLI se puede utilizar para estudiar las interacciones entre complejos efectores y dianas. Cuando se puede utilizar el método tradicional de ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA), la BLI puede actuar como un sustituto adecuado si se desean los beneficios proporcionados (mediciones en tiempo real sin etiquetas). [3]
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La interferometría de biocapa se puede utilizar para analizar la cinética en sistemas biomoleculares. Los beneficios que aporta la BLI proporcionan información adicional sobre la cinética además de los métodos de punto final comúnmente utilizados, como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). [1] Los patrones de interferencia encontrados en los experimentos de BLI se pueden utilizar para calcular constantes de velocidad y otros datos cinéticos en interacciones biomoleculares. [13] La sensibilidad (relativamente) menor del sensor BLI da como resultado una menor respuesta a los cambios en la composición de la muestra. Como resultado, la BLI también se puede utilizar para investigar los efectos alostéricos en los cambios conformacionales de las enzimas. [14]
Tanto BLI como SPR son tecnologías dominantes en el mercado de instrumentos sin etiquetas. [1] A pesar de compartir algunas similitudes en el concepto, existen diferencias significativas entre las dos técnicas. La SPR microfluídica se basa en una arquitectura cerrada para transportar muestras a un chip sensor estacionario (Figura 4). BLI, en cambio, utiliza un sistema abierto, agitando múltiples pocillos en una placa para transportar los sensores a las muestras sin necesidad de microfluídica . [6] Al ser un sistema cerrado, las fases de asociación y disociación de SPR están limitadas por el diseño de la tecnología. El diseño de placa abierta de BLI da como resultado límites de longitud de asociación y disociación determinados por la evaporación de la muestra. [15] La SPR es fácilmente reproducible debido a su microfluídica de flujo continuo. El diseño de placa de múltiples pocillos de BLI permite un rendimiento extremadamente alto en un lote. La configuración de ensayo en BLI puede, en condiciones estables, permitir la recuperación de muestras. La configuración de ensayo en SPR permite una mayor sensibilidad. Como resultado, los resultados de BLI a menudo se comparan con los resultados de SPR para su validación. [16]