La prueba muscular in vitro es un método utilizado para caracterizar las propiedades del tejido muscular vivo después de extraerlo de un organismo, lo que permite una cuantificación más amplia y precisa de sus propiedades que la prueba in vivo . La prueba muscular in vitro ha proporcionado la mayor parte del conocimiento científico sobre la estructura y la fisiología muscular, y cómo ambas se relacionan con el rendimiento del organismo. La investigación con células madre se basa en la prueba muscular in vitro para establecer la función de las células musculares y su comportamiento individual, aparte de las células musculares, en presencia de células no musculares observadas enestudios in vitro . [1]
Una vez que se ha seleccionado un animal apropiado, ya sea para una función locomotora específica (por ejemplo, ranas para saltar); o una cepa animal específica, para responder a una pregunta de investigación, se identifica un músculo específico en función de su función in vivo y la distribución del tipo de fibra. Después de la aprobación ética, y si es necesario, la aprobación del gobierno, el animal es sacrificado humanitariamente. Los métodos humanitarios difieren según el país, y el más apropiado se basa en la aprobación ética y el nivel de habilidad del investigador. Se deben seguir una serie de criterios adicionales para garantizar que el animal esté completamente muerto sin posibilidad de recuperación, lo que incluye el cese del flujo sanguíneo mediante la extracción del corazón del sistema circulatorio y/o la destrucción completa del cerebro y la columna vertebral. Después de esto, generalmente se obtienen rápidamente medidas comunes de la morfología animal, como la longitud del animal, la masa corporal y otros marcadores biomecánicos que pueden ser importantes. Luego, el animal se prepara para la extracción del músculo objetivo. En los músculos aislados, estos tienden a ser músculos de las extremidades traseras, como el sóleo o EDL de los mamíferos, o el plantar o iliotibial de los anfibios. Otros músculos que se han examinado in vitro incluyen el diafragma y el músculo papilar .
Para aislar con éxito los músculos esqueléticos, se requieren condiciones específicas. El tejido debe aislarse en una solución de Ringer o de Krebs-Henseleit fría y cambiada con frecuencia para garantizar que las condiciones metabólicas se ralenticen (de ahí la necesidad de un medio de disección frío) y para evitar que el tejido muera debido a la falta de sustratos en el medio (de ahí la necesidad de cambiar las soluciones con frecuencia). La solución de disección debe oxigenarse continuamente con la concentración adecuada de oxígeno y dióxido de carbono para el tejido que se está preparando. Por lo general, los tejidos no mamíferos se preparan en una solución gaseosa burbujeante con 98 % de oxígeno y 2 % de dióxido de carbono, mientras que los tejidos mamíferos se preparan en una solución burbujeante con 95 % de oxígeno y 5 % de dióxido de carbono. Se requiere un microscopio con un nivel de aumento adecuado debido a la destreza necesaria para aislar los músculos. Una fuente de luz externa de fibra óptica también es beneficiosa para proporcionar suficiente luz sin la emisión de calor.
No existe un método correcto para la preparación de los músculos para la prueba, siempre que el músculo no se dañe durante la preparación, la unidad músculo-tendón esté intacta y haya algo que se pueda utilizar para anclar el músculo dentro del equipo de prueba. Se pueden dejar trozos de hueso en el extremo proximal y/o distal de los músculos esqueléticos para permitir el anclaje. Además, se pueden utilizar suturas de seda o clips de aluminio en forma de T para envolver el tendón del músculo y proporcionar soporte al tendón y para utilizarlos como anclaje en el equipo de mecánica.
Las pruebas musculares in vitro suelen requerir un servomotor de modo dual, que puede controlar y detectar cambios en la fuerza y la longitud. Si no se dispone de un sistema de modo dual, se puede utilizar un transductor de fuerza independiente y un brazo motor. Un extremo del tejido de muestra se fija en su lugar, mediante una aguja si se sutura o una pinza de cocodrilo si se prepara con pinzas de aluminio en forma de T, mientras que el otro extremo se conecta al servomotor. Todo el músculo se baña en solución de Ringer o solución de Krebs-Henseleit con oxígeno burbujeando a través de ella para mantener el tejido vivo y metabólicamente activo. La solución se calienta, normalmente mediante un baño de agua externo con calentador/enfriador, a una temperatura de prueba adecuada para el músculo que se está probando. Los músculos se estimulan para que se contraigan aplicando corriente eléctrica al nervio que inerva el músculo o mediante electrodos de platino colocados en la solución circulante para provocar una respuesta de todo el músculo. El servomotor detecta cambios en la fuerza y/o la longitud debido a la contracción muscular . El nivel de estimulación se suele establecer en el nivel que garantiza el reclutamiento máximo de unidades motoras . El servomotor se puede programar para mantener una fuerza determinada mientras se permite que el músculo cambie de longitud, viceversa, o el músculo puede someterse a pruebas más complejas, como en bucles de trabajo . Cuando se utilizan músculos peniformes , a menudo se utiliza la sonomicrometría para determinar con precisión la longitud de la fibra durante la prueba.
Las pruebas musculares in vitro se pueden realizar en cualquier escala de organización muscular: grupos enteros de músculos (siempre que compartan una inserción u origen común, como en el cuádriceps humano), un solo músculo, un "haz" de fibras musculares , una sola fibra muscular, una sola miofibrilla, un solo sarcómero , un cardiomiocito o incluso la mitad de un sarcómero. Las fibras musculares pueden estar intactas o pueden estar "despellejadas", un proceso que elimina la membrana celular, el retículo sarcoplásmico y el citoplasma, lo que permite un mayor acceso a los componentes contráctiles del sarcómero.
Se prueban comúnmente varias propiedades, y un experimento determinado a menudo utilizará un subconjunto de estas propiedades, incluidos los tiempos de contracción, la fuerza tetánica, la relación fuerza-longitud, la relación fuerza-velocidad, los bucles de trabajo , los ensayos de fatiga, la frecuencia de fusión y el costo energético.
Recientemente se ha utilizado un método híbrido entre in vitro e in vivo , denominado in situ , en el que el organismo se somete a anestesia terminal y se realizan pruebas in vivo con el músculo todavía adherido al organismo. Esto garantiza que el músculo se mantenga a la temperatura adecuada y reciba abundantes nutrientes y oxígeno de la sangre, pero el procedimiento es más difícil y algunas pruebas pueden no ser posibles. [2]
Las pruebas musculares in vitro casi nunca se utilizan en humanos, con la excepción de pequeñas secciones de músculo extraídas mediante biopsia o durante una cirugía por otras dolencias. Las pruebas son generalmente más difíciles en mamíferos y aves debido a la alta temperatura y los requisitos de oxígeno del músculo, lo que lleva a una muerte celular rápida una vez que el tejido muscular se extrae del organismo. Los músculos esqueléticos de mamíferos se prueban comúnmente a ~25 °C para prolongar el protocolo de prueba durante el mayor tiempo posible. También se puede utilizar una temperatura de prueba de ~37 °C durante la prueba de músculos esqueléticos de mamíferos aislados completos para replicar mejor la temperatura encontrada in vivo . Además, es importante considerar la especialización térmica de los músculos esqueléticos, ya que los músculos centrales son más susceptibles a los cambios en el rendimiento mecánico con pequeños cambios de temperatura que los músculos periféricos. [3] En los ectotérmicos (reptiles, anfibios, peces e invertebrados), el tejido muscular puede sobrevivir fuera del organismo durante horas o incluso días, según la temperatura y el organismo. Se realizan muchos experimentos a temperaturas cercanas a los 0 °C para prolongar la vida útil del músculo. Además, en peces y anfibios es posible separar una sola fibra muscular y mantenerla intacta, pero en otras especies esto no suele ser posible.
El aislamiento del tejido muscular in vitro permite obtener datos individuales de la función de las células musculares sin la presencia de células no musculares señalizadoras cercanas. [1] Las pruebas in vitro permiten una estimulación exacta del músculo, lo que proporciona datos precisos sobre el comportamiento innato del tejido. [4] Las pruebas musculares aisladas limitan otros factores del entorno que rodea al tejido, como los sustratos. Las pruebas musculares aisladas in vitro son un procedimiento beneficioso basado en su exactitud, precisión y reproducibilidad ideales. [5]
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