La expresión heteróloga se refiere a la expresión de un gen o parte de un gen en un organismo huésped que no tiene de forma natural el gen o fragmento de gen en cuestión. La inserción del gen en el huésped heterólogo se realiza mediante tecnología de ADN recombinante . El propósito de la expresión heteróloga es a menudo determinar los efectos de las mutaciones y las interacciones diferenciales en la función de las proteínas. Proporciona una vía sencilla para expresar y experimentar de forma eficiente con combinaciones de genes y mutantes que no se dan de forma natural.
Dependiendo de la duración de la recombinación en el genoma del huésped, existen dos tipos de expresión heteróloga: a largo plazo (estable) y a corto plazo (transitoria). La expresión a largo plazo es una integración potencialmente permanente en el gen y la expresión a corto plazo es una modificación temporal que dura entre 1 y 3 días. [1]
Después de ser insertado en el huésped, el gen puede integrarse en el ADN del huésped , causando una expresión permanente, o no integrarse, causando una expresión transitoria . La expresión heteróloga puede realizarse en muchos tipos de organismos huéspedes. El organismo huésped puede ser una bacteria, una levadura, una célula de mamífero o una célula vegetal. Este huésped se denomina " sistema de expresión ". La expresión homóloga, por otro lado, se refiere a la sobreexpresión de un gen en un sistema del que se origina.
La identificación de genes se puede lograr utilizando métodos informáticos conocidos como técnicas de detección heteróloga. [2] Una biblioteca digital de secuencias de ADNc tiene datos de muchos proyectos de secuenciación y permite un fácil acceso a la información de secuencias de genes conocidos.
Si una secuencia genómica es desconocida o no está disponible, el ADN se somete a un proceso de fragmentación aleatoria, clonación y cribado para determinar su fenotipo. [3] Aunque se pueden utilizar varios métodos para obtener un gen en particular, la forma más fácil de revelar los componentes de una secuencia de ADN desconocida es identificando primero sus enzimas de restricción. Las enzimas de restricción son enzimas responsables de escindir el ADN en fragmentos en un sitio específico dentro de las moléculas conocidas como sitios de restricción . Estas enzimas pueden estar ubicadas en bacterias o arqueas y se sabe que protegen el ADN de la invasión extraña de virus. Las enzimas de restricción son distintas, y cada una reconoce solo una secuencia específica de pares de bases dentro del ADN, muchas de las cuales tienden a ser palindrómicas . Al localizar cada enzima, se puede identificar y aislar la secuencia asociada con la enzima de restricción.
Si se conoce la secuencia, se puede utilizar una técnica denominada reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para aislar un gen de interés. El objetivo de la PCR no es solo identificar, sino también amplificar un segmento de ADN particular a través de fases de desnaturalización, hibridación y extensión. La desnaturalización coloca una plantilla de ADN bicatenario en condiciones de alta temperatura de 95 °C para romper sus débiles enlaces de hidrógeno y forzar la separación de las hebras. La hibridación enfría la reacción para permitir que los enlaces de hidrógeno se reformen y promuevan la unión del cebador a sus secuencias complementarias en la plantilla de ADN monocatenario. Finalmente, el paso de extensión implica que la ADN polimerasa reconozca el ADN monocatenario cebado y, por lo tanto, aísle las secuencias específicas necesarias para la replicación. [3]
La administración mediante pistolas genéticas /biolística ha sido un método atractivo para la administración de genes debido a sus propiedades no virales y, además de la transducción viral, es uno de los métodos más comunes. Esto permite respuestas inmunes menos adversas y una menor probabilidad de infección viral en comparación con los métodos de transferencia basados en virus. En lugar de utilizar un vector viral, esta técnica utiliza métodos físicos, específicamente utilizando propulsión de helio para administrar vectores de transformación. La administración mediante pistolas genéticas se ha utilizado tradicionalmente para la generación de plantas transgénicas, ya que ha podido penetrar de manera eficiente y eficaz las paredes celulares. Más recientemente, esta técnica ha tenido éxito en células animales que no pueden tolerar bombardeos de alto nivel, donde en su lugar se administran partículas de oro de ADN a una presión de helio más baja. Este método se ha utilizado con éxito tanto in vitro como in vivo. [4]
La electroporación es un método que utiliza alto voltaje para crear poros en las membranas de las células de los mamíferos. Al aplicar pulsos eléctricos, se desestabilizan transitoriamente áreas locales de la membrana celular y el ADN puede entonces entrar en la célula. Con intensidades de campo adecuadas, el daño a la célula huésped es mínimo. [5] Esta técnica se puede utilizar tanto para transfectantes a corto como a largo plazo. [6] También es eficaz con casi cualquier tipo de tejido y ha mostrado altos niveles de entrega de genes con un aumento en la distribución de células que expresan el ADN. [5]
La transducción viral es un método que utiliza vectores virales y se utiliza para la introducción estable de genes en las células diana. En este método, el vector viral (virión) infecta las células huésped mediante el transporte directo de ADN al núcleo de la célula. Dos tipos comunes de virus utilizados para la transducción son los adenovirus, que tienden a ser transitorios, y los lentivirus, que integran el ADN en el genoma. Los vectores lentivirales también han sido una herramienta viral atractiva porque pueden transducir en células que no se dividen, lo que permite una transferencia estable en una amplia gama de tipos de células huésped. [7]
En la lipofección , el gen se inyecta con la ayuda de liposomas . La secuencia de ADN se encapsula en un liposoma con la misma composición que la membrana celular. Este método permite que se fusione directamente con la membrana, o que se endocite, lo que luego libera el ADN en la célula. La lipofección se utiliza a menudo porque funciona con muchos tipos de células diferentes, es altamente reproducible y es un método rápido tanto para la expresión estable como transitoria. [8]
Los genes se someten a expresión heteróloga a menudo para estudiar interacciones de proteínas específicas. E. coli , levadura ( S. cerevisiae , P. pastoris ), células de mamíferos inmortalizadas y ovocitos de anfibios (es decir, huevos no fertilizados) son comúnmente para estudios que requieren expresión heteróloga. [9] Al elegir un sistema particular, se deben considerar aspectos económicos y cualitativos. La expresión procariota se usa ampliamente en la tecnología de ADN recombinante para formar proteínas fácilmente manipulables mediante métodos genéticos bien conocidos con un medio de bajo costo. [10] Algunas limitaciones incluyen la acumulación intracelular de proteínas heterólogas, el plegamiento inadecuado del péptido, la falta de modificaciones postranscripcionales, el potencial de degradación del producto debido a trazas de impurezas de proteasa y la producción de endotoxina.
Los sistemas procariotas y eucariotas, más comúnmente bacterias, levaduras, insectos y células de mamíferos, y ocasionalmente anfibios, hongos y protistos, se utilizan para estudios que requieren expresión heteróloga. Las bacterias, especialmente E. coli, levaduras (S. cerevisiae, P. pastoris), insectos y células de anfibios (ovocitos) se han utilizado como huéspedes efectivos para expresar proteínas extrañas. En general, es más fácil trabajar con procariotas y se comprenden mejor, y a menudo son el sistema huésped preferido. Se utiliza ampliamente en la tecnología del ADN recombinante para formar proteínas fácilmente manipulables mediante métodos genéticos bien conocidos con un medio de bajo costo. Sin embargo, para las proteínas de membrana, los investigadores han observado que las células de mamíferos son más efectivas. Esto se debe a que existe una falta de modificaciones postranscripcionales en los sistemas procariotas. Las limitaciones incluyen la acumulación intracelular de proteínas heterólogas, el plegamiento inadecuado del péptido, el potencial de degradación del producto debido a trazas de impurezas de proteasas y la producción de endotoxinas.
Un sistema popular utilizado es Escherichia coli debido a su rápida tasa de crecimiento (~20–30 minutos), capacidad para fermentación continua y costo relativamente bajo. [9] Además, la levadura tiene la capacidad de expresar un alto volumen relativo de proteína heteróloga. Específicamente, hasta el 30% de las proteínas producidas en levadura pueden ser el producto del gen heterólogo. También hay cepas seguras de E. coli que se han generado con éxito para aumentar la producción. Además de las atractivas propiedades del hospedador de E. coli, este hospedador es increíblemente popular debido a que los investigadores tienen una gran cantidad de conocimiento sobre su genética, incluida la secuencia genómica completa. Sin embargo, surgen problemas debido a la secuencia del gen de interés y aquellos que se deben a las limitaciones de E. coli como hospedador. Por ejemplo, las proteínas expresadas en grandes cantidades en E. coli tienden a precipitarse y agregarse, lo que luego requiere otro método de recuperación de desnaturalización y renaturalización. Finalmente, E. coli solo es óptimamente eficaz en condiciones específicas que dependen del gen que se inserte.
Bacillus subtilis (B. subtilis) es un organismo grampositivo, no patógeno que no produce lipopolisacáridos (LPS). Se sabe que el LPS, que se encuentra en las bacterias gramnegativas, causa muchos trastornos degenerativos en humanos y animales y afecta la producción de proteínas en E. coli. Por lo tanto, aunque se considera potencialmente seguro, B. subtilis no ha sido categorizado oficialmente como generalmente considerado por la FDA como seguro (GRAS). B. subtilis tiene características genéticas que lo transforman fácilmente con bacteriófagos y plásmidos . [11] Además, puede facilitar más pasos de purificación a través de la secreción directa en el medio de cultivo , y se puede ampliar fácilmente debido a su capacidad para secretar estas proteínas de manera no específica. Hasta la fecha, B. subtilis se ha utilizado para estudiar con éxito diferentes mecanismos biológicos, incluido el metabolismo, la regulación genética, la diferenciación y la expresión de proteínas y la generación de productos bioactivos. También es la bacteria grampositiva más estudiada del mundo, y la información genómica está ampliamente disponible. Las desventajas de este sistema hospedador incluyen la expresión reducida o nula de la proteína de interés y la producción de proteasas extracelulares degradativas que atacan a las proteínas heterólogas. Finalmente, a pesar de las atractivas propiedades de B. subtilis, estas limitaciones hacen que E. coli sea el sistema hospedador por defecto en lugar de B. subtilis. Sin embargo, con más investigación y optimización, B. subtilis tiene el potencial de producir proteínas de membrana a gran escala. [12]
Las células eucariotas se pueden utilizar como una alternativa a la expresión procariota de proteínas destinadas a uso terapéutico. La levadura es un hongo unicelular que utiliza altos niveles de expresión, crecimiento rápido y mantenimiento económico, similar a los sistemas procariotas. Debido a que la levadura es un organismo alimentario, también es favorable para la producción de productos farmacéuticos, a diferencia de E. coli que puede contener toxinas. La levadura también tiene una tasa de crecimiento relativamente rápida, con un tiempo de duplicación de 90 minutos en medios simples, y se manipula fácilmente. Al igual que E. coli, la levadura también tiene disponible la secuencia genómica completa. La levadura más utilizada es S. cerevisiae, que puede llevar a cabo modificaciones postraduccionales como el procesamiento de proteínas y el plegamiento de proteínas. S. cerevisiae , P. pastoris son organismos eucariotas simples que crecen rápidamente y son muy adaptables. [13] Los sistemas eucariotas tienen aplicaciones humanas y han elaborado con éxito vacunas para la hepatitis B y el hantavirus . Existe un aumento progresivo en el uso de células de mamíferos para la tecnología recombinante y la síntesis de actividad biológica completa. Este sistema secreta y glicosila proteínas, al mismo tiempo que introduce un plegamiento proteico adecuado y modificaciones postraduccionales. Sin embargo, cuando se emplean capacidades de glicosilación aumentadas, a menudo se observa hipermanosilación, o la adición de una gran cantidad de manosa. Esto dificulta el plegamiento proteico adecuado. En general, la levadura es un compromiso entre las células bacterianas y de mamíferos, y sigue siendo un sistema huésped popular. El costo de producción para el uso de levadura como sistema de expresión es alto debido al crecimiento lento y al alto requerimiento de nutrientes.
Los baculovirus son virus que infectan a los insectos y han surgido como un sistema de expresión heteróloga en eucariotas (el insecto). Como eucariotas, tienen varias funciones importantes que no están presentes en los sistemas de levaduras y bacterias, incluyendo la modificación de proteínas, el procesamiento y el sistema de transporte eucariota. Debido a que se pueden propagar en concentraciones muy altas, simplifica el proceso de obtención de grandes cantidades de proteínas recombinantes. Además, los investigadores descubrieron que las proteínas expresadas suelen estar localizadas en sus respectivos compartimentos y son fáciles de recolectar. Estos genomas también tienden a ser muy grandes y pueden incorporar fragmentos más grandes en comparación con los sistemas procariotas, y también son no infecciosos para los vertebrados y las células de mamíferos. Sin embargo, estos vectores baculovirales están sujetos a limitaciones. Debido a que estos virus infectan de forma nativa a los invertebrados, podría haber diferencias en el procesamiento de proteínas de los vertebrados que provoquen algunas modificaciones dañinas. [14]
El ovocito no fertilizado de una rana, o Xenopus laevis, también se ha utilizado como un sistema de expresión para la expresión heteróloga. [15] Inicialmente utilizado para expresar el receptor de acetilcolina en 1982, desde entonces se ha utilizado por una variedad de razones. Estos ovocitos son producidos por ranas durante todo el año y por lo tanto son relativamente abundantes, y la traducción se produce con alta fidelidad. De las muchas limitaciones del sistema de ovocito, una de las principales es que las proteínas heterólogas producidas interactúan con las proteínas del ovocito de la rana, lo que cambia su comportamiento en comparación con lo que sería en una célula de mamífero. Además, donde los mamíferos son diploides, estos xenopus tienen cuatro copias homólogas de cada cromosoma y, por lo tanto, las proteínas derivadas pueden tener una función diferente. Se necesita más investigación para examinar la producción de proteínas de los sistemas de X. laevis.
Aunque el cultivo de células de mamíferos es más difícil, requiere más tiempo, más nutrientes y es significativamente más costoso, una proteína que requiere modificaciones postraduccionales debe expresarse en células de mamíferos para proteger la eficacia clínica y la fidelidad del producto. Sin embargo, incluso entre células de mamíferos, se observan diferencias, por ejemplo, diferencias en la glicosilación entre células de roedores y humanas. Incluso dentro de una línea celular, la estabilización de una línea celular a menudo da como resultado patrones de glicosilación modificados. La única forma comercialmente viable de utilizar células de mamíferos como sistemas hospedadores es un producto final de alto valor. Las líneas celulares de mamíferos comunes, especialmente en investigación, incluyen la COS-7 del mono Cercopithecus aethiops, la CHO del hámster Cricetulus griseus y la línea de riñón humano HEK293. [3]
Un sistema de expresión eucariota protista común es el moho mucilaginoso, Dictyostelium discoideum, y es único porque tiene un plásmido circular, empaquetado de manera similar a la cromatina. [16] Como organismo haploide eucariota simple, puede crecer en altas concentraciones sin las costosas condiciones del cultivo de células de mamíferos y realizar modificaciones postraduccionales. La proteína en sí se expresa en varias formas, incluidas las adheridas a la membrana, secretadas o asociadas a la célula, y puede glicosilar el producto proteico.
Los hongos son descomponedores naturales de muchos ecosistemas. Como resultado, pueden secretar grandes cantidades de enzimas, más que los sistemas basados en bacterias. Sin embargo, el uso de hongos como sistemas de expresión ha encontrado varias barreras, especialmente debido a la falta de conocimiento sobre la genética de los hongos debido a su complejidad inherente. Los hongos filamentosos han sido específicamente un sistema huésped de interés, e incluyen Penicillium (de donde se derivó la penicilina), Trichoderma reesei y Aspergillus Niger. Los hongos filamentosos son eficientes en la producción de proteínas extracelulares, evitando el paso adicional de la ruptura celular para extraer proteínas. Algunos también tienen condiciones de crecimiento y medios económicos. Los hongos también tienen capacidades de glicosilación y modificación que son útiles para las proteínas eucariotas. Además, también han producido con éxito proteínas relacionadas con vacunas, y algunos hongos filamentosos han sido considerados GRAS por la FDA. Sin embargo, el principal inconveniente de utilizar este sistema huésped es que los rendimientos son extremadamente bajos y no son económicamente viables. Además, la baja cantidad de proteína que se produce a menudo es degradada por las proteasas fúngicas. Algunas de las estrategias para abordar este problema han sido el uso de cepas deficientes en proteasas. Los investigadores también están probando diferentes métodos de alteración genética. Con una mejor comprensión de la regulación y expresión de los genes fúngicos, podemos esperar que los hongos filamentosos se conviertan en un posible sistema hospedador viable. [16]
Los investigadores suelen utilizar técnicas de expresión heteróloga para estudiar las interacciones entre proteínas. Por ejemplo, se ha optimizado la expresión heteróloga y la biosíntesis de la nitrogenasa en bacterias a través de NifEN. Esta se puede expresar y diseñar en E. coli. [17] A través de este huésped, sigue siendo extremadamente difícil expresar de forma heteróloga una metaloproteína heteromultimérica compleja como NifEN con un complemento completo de subunidades, metaloclusters y funcionalidad. La variante de NifEN diseñada en este huésped bacteriano puede conservar su eficacia como cofactor en sitios de unión de cofactores análogos, lo que proporciona una prueba de la expresión heteróloga y fomenta la investigación futura de esta metaloenzima. Además, ha habido informes recientes sobre la utilidad de nuevos sistemas fúngicos filamentosos en la producción de proteínas industriales. Las ventajas incluyen altas frecuencias de transformación, la producción de proteínas a pH neutro, baja viscosidad del caldo de fermentación debido a la selección de cepas para un formato no filamentoso y tiempos de fermentación cortos. Muchos productos genéticos humanos, como la albúmina, la IgG y la interleucina 6, se han expresado en sistemas heterólogos con distintos grados de éxito. [18] Los resultados inconsistentes han dado a entender que se ha producido un cambio desde los estudios gen por gen hacia un enfoque de modificación postraduccional en todo el organismo. Los ovocitos se optimizan fácilmente por su gran tamaño y capacidad de traducción, lo que permite observar respuestas celulares integradas. Esto se aplica a estudios de moléculas individuales dentro de células individuales y a aplicaciones de cribado de fármacos de mediano rendimiento. Al cribar ovocitos para la expresión de ADNc inyectado, se puede estudiar más a fondo la aplicación de la microinyección como modelo para la expresión heteróloga en términos de señalización celular, transporte, arquitectura y función proteica. [15]
Los sistemas de expresión heteróloga se pueden incorporar clínicamente para evaluar la actividad enzimática en condiciones altamente reproducibles para el desarrollo de fármacos in vitro. [19] [13] Esto funciona para minimizar el riesgo del paciente al servir como una alternativa a los procedimientos altamente invasivos o al potencial desarrollo de reacciones adversas a los medicamentos. El análisis de la actividad enzimática requiere varios sistemas de expresión para clasificar las variantes enzimáticas. A diferencia de otros animales, la expresión de proteínas recombinantes funcionales es un proceso costoso para las células de mamíferos específicamente, debido a los bajos niveles de expresión de enzimas que contribuyen al metabolismo de los fármacos. Como resultado, los procesos de modificación postraduccional difieren entre especies y limitan las comparaciones precisas. El primer producto proteico heterólogo lanzado al mercado fue la insulina humana , más comúnmente conocida como Humulina . Este producto se elaboró con una cepa de E. coli. La mayoría de las bacterias, incluida la E. coli, no pueden secretar con éxito dichas proteínas, lo que requiere la recolección de células adicional, la disrupción celular y los pasos de aislamiento del producto antes de la purificación de la proteína.
Al igual que la humulina, se han obtenido muchos resultados satisfactorios con la expresión heteróloga para el desarrollo de fármacos. La expresión heteróloga a través de la clonación de genes que producen productos bioactivos naturales de interés también se puede expresar en sistemas hospedadores y ampliar para la producción de fármacos. Por ejemplo, varios productos naturales clínicamente relevantes en hongos son difíciles de cultivar en entornos de laboratorio. Sin embargo, después de la identificación de los grupos de genes activos correspondientes, estos genes se pueden clonar en levaduras y expresar también para producir el producto de interés de una manera más rentable y eficaz en cuanto a tiempo. Este método también se puede utilizar para descubrir nuevos fármacos. En este experimento, se pueden caracterizar y expresar secuencias genéticas fúngicas no estudiadas previamente, lo que permite la producción de nuevos productos naturales. [20] Sin embargo, con la mutagénesis de genes hacia un compuesto biológicamente más relevante, este se puede expresar para producir un nuevo producto modificado genéticamente. [21]
Otro uso importante de la expresión heteróloga es el de examinar diferentes fármacos en un sistema huésped en lugar de en un sistema nativo más caro o difícil de mantener. Un ejemplo de esto sería el uso de Mycobacterium marinum como sistema huésped alternativo en comparación con el uso directo de Mycobacterium tuberculosis. M. tuberculosis requiere instalaciones de alto nivel de bioseguridad para la detección de fármacos y tiene una tasa de crecimiento lenta, lo que hace que el proceso sea costoso y lleve mucho tiempo. Por lo tanto, los investigadores probaron un M. marinum estrechamente relacionado y menos peligroso, cuya expresión heteróloga de dos activadores de fármacos, se convirtió en un modelo preciso para probar fármacos contra la tuberculosis. [22] Un ejemplo que examina un objetivo farmacológico más específico es la expresión heteróloga de proteínas de canales iónicos para probar diferentes fármacos de canales iónicos cardíacos que alteran su función para abordar la enfermedad cardíaca. [23] De manera similar, la detección de fármacos puede ocurrir con la expresión heteróloga de receptores clonados. [24] Los beneficios de usar la expresión heteróloga aquí es que produce grandes cantidades de receptores objetivo de fármacos de interés y, en general, es inagotable, reproducible y económica. Estos receptores podrían utilizarse en ensayos para comprobar la eficacia y la especificidad de la unión de fármacos. Además, los propios receptores producidos podrían utilizarse como agentes terapéuticos. Podrían servir como señuelos para toxinas o moléculas de señalización en exceso y unirse a estas moléculas o atenuarlas.
La tecnología recombinante también ha desempeñado un papel en el desarrollo de biocombustibles. Esto se ha explorado utilizando sistemas de expresión encontrados en bacterias, plantas y levaduras. Específicamente, la expresión heteróloga de enzimas celulasas utiliza celulosa , la materia prima más abundante en todo el mundo. Las enzimas celulolíticas se encuentran en plantas, insectos, bacterias y hongos, que ayudan en la conversión de biomasa en biocombustible. [25] Específicamente, la celulosa se hidroliza para formar moléculas de azúcar. Por ejemplo, la manipulación de los niveles de expresión celular en enzimas celulolíticas es necesaria en huéspedes fúngicos para superar la degradación. Sin embargo, el bioprocesamiento ha demostrado ser difícil en la formación de proteínas de alto rendimiento y requiere la incorporación de otras enzimas. Varias cepas microbianas se pueden combinar para expresar enzimas que resulten en un aumento total del rendimiento enzimático en una escala económicamente viable. [25]
El arroz dorado es un OGM creado en 2005 a través de expresión heteróloga como un esfuerzo humanitario para abordar los efectos de la deficiencia de vitamina A. El arroz Oryza sativa fue transfectado con un gen para producir β-caroteno, un precursor de la vitamina A que tiene un color amarillo anaranjado. [26]
Varias limitaciones impiden la expresión heteróloga para generar productos a un nivel económicamente factible que se han observado en bacterias, levaduras y plantas. [25] En primer lugar, estos métodos siguen siendo extremadamente caros en comparación con la producción natural, a menudo requieren más tiempo para generarse y requieren condiciones especiales para el cultivo del huésped y la inducción de la expresión. Además, la mayoría de los métodos aún no se han optimizado, y algunos incluso tienen una expresión menor que el organismo nativo. Especialmente con los genes biosintéticos para productos biológicamente activos naturales de interés, los investigadores han descubierto que se expresan muy mal en condiciones de laboratorio, especialmente debido a los tamaños de genes generalmente grandes. [27] Aunque se producen productos proteicos, a menudo se generan con un rendimiento muy bajo, se secretan mal debido a la baja solubilidad o producen otros subproductos no deseados. Los casos exitosos de producción heteróloga de productos objetivo se observan principalmente con genes de baja complejidad con una pequeña cantidad de operones. Esto a menudo se debe al desajuste en las vías y la maquinaria de regulación y inducción de la expresión, y se refleja en la degradación observada de ciertas secuencias de aminoácidos, la disminución de la actividad específica, el transporte incorrecto de la membrana y los efectos de glicosilación. Además, existen barreras durante el proceso de traducción, donde los efectos del ARNt del huésped reducen la eficiencia de la traducción, específicamente el reconocimiento por los ribosomas del huésped. De manera similar, las modificaciones a las bases unidas al ARNt que difieren del sistema huésped pueden reducir la traducción de proteínas cuantitativa y cualitativamente. Por ejemplo, traducir un gen extraño en otro sistema huésped que no contenía el ARNt requerido resultó en una terminación temprana en el codón donde faltaba el ARNt. Colectivamente, con la expresión heteróloga, cuando los sistemas de traducción del huésped son diferentes del sistema nativo desde el que se están introduciendo los genes, son frecuentes los errores de codificación, los cambios de marco o la terminación prematura o incorrecta de la secuencia. En consecuencia, esto conduce a un menor rendimiento de proteínas funcionales o a una sobreexpresión no intencionada de la proteína. Estos errores son especialmente prominentes con el aumento significativo y antinatural de la demanda de maquinaria biológica del sistema huésped. A menudo, esto provoca la reasignación de recursos celulares de los procesos normales a la producción de la proteína heteróloga. Específicamente, esto pone a prueba el suministro de ARNt y aminoácidos, los sistemas de control de calidad y los sistemas de secreción, así como el NADPH necesario para los procesos anabólicos. Además, la acumulación no natural de proteínas heterólogas también conduce a efectos adversos para el huésped. [28] En general, las implicaciones no solo son evidentes en bajos rendimientos del producto, sino también en respuestas de estrés del huésped y una menor viabilidad del huésped.
Existen muchas áreas de investigación activa que abordan estas limitaciones de la utilización de la expresión heteróloga, especialmente en un entorno comercial. Un enfoque es determinar el sistema huésped óptimo para cada producto proteico objetivo específico, ya que las proteínas diferentes, especialmente las no nativas, a menudo tienen un comportamiento desviado en otros organismos, y algunos sistemas huéspedes pueden producir mayores rendimientos o requerir condiciones más suaves que otros. En concreto, la incorporación de diferentes promotores o secuencias genéticas optimizadas y el uso de variantes o cepas de organismos que permitan estas modificaciones postraduccionales es un enfoque de interés. Por ejemplo, las variantes que tienen una secreción eficiente pueden permitir que la producción de productos de expresión heteróloga sea relevante a nivel industrial. Además, aumentar la disponibilidad de cofactores, mejorar la capacidad de plegamiento de proteínas, mejorar los promotores genéticos y diseñar sistemas de control que cambien en función de las diferentes demandas de recursos. Otro enfoque es la incorporación de períodos transitorios en los que se reduce la producción heteróloga para permitir la recuperación del sistema huésped. Para abordar los errores en la traducción, es posible sobreexpresar ARNt para mitigar cualquier escasez, sin embargo, las modificaciones de bases siguen dependiendo en gran medida del sistema huésped. [28] Los científicos han intentado diseñar un sistema universal para intentar mitigar estas preocupaciones, pero todavía queda mucho por descubrir sobre la conexión entre los huéspedes y los productores nativos, y las implicaciones de la mayor carga sobre los sistemas huéspedes.
Los avances en la tecnología del ADN recombinante han revolucionado la idea de tratar enfermedades mediante la reconstrucción o reemplazo de genes defectuosos. La terapia génica es una técnica que trasplanta genes normales a células que contienen genes faltantes o defectuosos para corregir trastornos genéticos. Sin embargo, se han planteado varias preocupaciones sobre la eficacia de la terapia génica debido a su tasa de éxito limitada en los ensayos clínicos. [29] [30] A lo largo de los años, se han realizado inmensos esfuerzos para comprender completamente los vectores, los virus y su comunicación con el sistema inmunológico de su huésped. Sin embargo, no todos los sistemas de defensa reaccionan de la misma manera. Algunos pacientes han experimentado una respuesta "similar a la autoinmune" en la que su cuerpo rechaza este tratamiento. Los genes heterólogos son reconocidos como extraños para el huésped y pueden inducir respuestas inflamatorias mediadas por citocinas que finalmente son destruidas por sus células T citotóxicas. Esto ha puesto en tela de juicio la relación entre la dosis del vector y la toxicidad celular, ya que los científicos reconocen que la activación inapropiada de estas respuestas puede causar efectos secundarios graves no solo en las células infectadas por la enfermedad sino también en otras partes sanas del cuerpo. [29]
La modificación genética utilizada para abordar preocupaciones fuera de las necesidades médicas, como el color de los ojos, las habilidades atléticas, la inteligencia, etc., es un ejemplo que ha puesto en tela de juicio la ética de su propósito. [31] La eugenesia , que coloca un grupo de características humanas deseables sobre otro, ha generado temores de una posible reacción negativa hacia los individuos genéticamente modificados o genéticamente no modificados en la sociedad. En el caso de la edición de la línea germinal, no hay garantía de que el tratamiento proporcione una cura absoluta durante toda la vida del paciente y/o si esos genes pueden transmitirse a su descendencia. [32] Aunque CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) , una técnica que permite editar genes con facilidad puede presentar ciertos beneficios, pero también puede causar más riesgos para el cuerpo humano. Por ejemplo, puede haber limitaciones técnicas para la edición CRISPR. Hasta que se realicen avances para equipar completamente a los científicos con el conocimiento para comprender todos los posibles beneficios y riesgos asociados con la edición CRISPR, persisten las preocupaciones sobre la seguridad de sus aplicaciones. [32] La posibilidad de que la edición pueda dar lugar a una secuencia genética incompleta o inexacta se ha informado en varios experimentos relacionados con estudios de líneas celulares tanto animales como humanas. [32] Dado que es casi imposible predecir un resultado favorable con certeza, esta técnica hace que la edición de la línea germinal sea aún más difícil de promover como una cura definitiva para cualquier persona que sufra enfermedades terminales.
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