En bioquímica y biología celular , la centrifugación diferencial (también conocida como centrifugación de velocidad diferencial ) es un procedimiento común utilizado para separar orgánulos y otras partículas subcelulares en función de su velocidad de sedimentación . Aunque a menudo se aplica en análisis biológicos, la centrifugación diferencial es una técnica general también adecuada para la purificación cruda de partículas suspendidas no vivas (por ejemplo, nanopartículas , partículas coloidales , virus ). En un caso típico en el que se utiliza la centrifugación diferencial para analizar fenómenos biológicos celulares (por ejemplo, distribución de orgánulos), primero se lisa una muestra de tejido para romper las membranas celulares y liberar los orgánulos y el citosol . Luego, el lisado se somete a centrifugaciones repetidas , donde las partículas que sedimentan lo suficientemente rápido a una fuerza centrífuga dada durante un tiempo dado forman un "pellet" compacto en el fondo del tubo de centrifugación. [1]
Después de cada centrifugación, el sobrenadante (solución no granulada) se retira del tubo y se vuelve a centrifugar con una fuerza centrífuga y/o tiempo mayores. La centrifugación diferencial es adecuada para separaciones crudas en función de la velocidad de sedimentación, pero se pueden realizar purificaciones más finas en función de la densidad mediante centrifugación en gradiente de densidad de equilibrio . [2] Por lo tanto, el método de centrifugación diferencial es la granulación sucesiva de partículas del sobrenadante anterior, utilizando fuerzas de centrifugación cada vez mayores. [3] Los orgánulos celulares separados por centrifugación diferencial mantienen un grado relativamente alto de funcionamiento normal, siempre que no estén sujetos a condiciones desnaturalizantes durante el aislamiento. [4] [5]
En un fluido viscoso, la velocidad de sedimentación de una partícula suspendida determinada (siempre que la partícula sea más densa que el fluido) es en gran medida una función de los siguientes factores:
Las partículas más grandes sedimentan más rápidamente y con fuerzas centrífugas más bajas. Si una partícula es menos densa que el fluido (por ejemplo, grasas en agua), la partícula no sedimentará, sino que flotará, independientemente de la fuerza de gravedad que experimente la partícula. La fuerza centrífuga separa los componentes no solo en función de la densidad, sino también del tamaño y la forma de las partículas. Por el contrario, una centrifugación de gradiente de densidad en equilibrio más especializada produce un perfil de separación que depende solo de la densidad de las partículas y, por lo tanto, es adecuada para separaciones de grano más fino.
Una fuerza g elevada hace que la sedimentación de partículas pequeñas sea mucho más rápida que la difusión browniana , incluso para partículas muy pequeñas (a escala nanométrica). Cuando se utiliza una centrífuga, se debe modificar la ley de Stokes para tener en cuenta la variación de la fuerza g con la distancia desde el centro de rotación. [6]
dónde
La centrifugación diferencial se puede utilizar con partículas intactas (por ejemplo, células biológicas, micropartículas, nanopartículas) o para separar los componentes de una partícula determinada. [7] Utilizando el ejemplo de una separación de orgánulos eucariotas de células intactas, primero se debe lisar y homogeneizar la célula (idealmente mediante una técnica suave, como la homogeneización de Dounce ; las técnicas más duras o la homogeneización excesiva darán lugar a una menor proporción de orgánulos intactos). Una vez obtenido el extracto crudo de orgánulos, se puede someter a distintas velocidades de centrifugación para separar los orgánulos:
La muestra lisada ya está lista para la centrifugación en una ultracentrífuga . Una ultracentrífuga consiste en una cámara refrigerada de baja presión que contiene un rotor accionado por un motor eléctrico capaz de girar a alta velocidad. Las muestras se colocan en tubos dentro del rotor o unidos a él. La velocidad de rotación puede alcanzar hasta 100 000 rpm para el modelo de suelo, 150 000 rpm para el modelo de sobremesa (Beckman Optima Max-XP o Sorvall MTX150 o himac CS150NX), creando fuerzas de velocidad centrífuga de 800 000 g a 1 000 000 g. Esta fuerza provoca la sedimentación de macromoléculas e incluso puede causar distribuciones no uniformes de moléculas pequeñas. [8]
Dado que los diferentes fragmentos de una célula tienen diferentes tamaños y densidades, cada fragmento se sedimentará en un sedimento con diferentes fuerzas centrífugas mínimas. Por lo tanto, la separación de la muestra en diferentes capas se puede realizar centrifugando primero el lisado original con fuerzas débiles, retirando el sedimento y luego exponiendo los sobrenadantes posteriores a campos centrífugos secuencialmente mayores. Cada vez, una porción de diferente densidad se sedimenta en el fondo del recipiente y se extrae, y la aplicación repetida produce una serie de capas que incluye diferentes partes de la muestra original. Se pueden tomar medidas adicionales para refinar aún más cada uno de los sedimentos obtenidos.
La sedimentación depende de la masa, la forma y el volumen específico parcial de una macromolécula, así como de la densidad del disolvente, el tamaño del rotor y la velocidad de rotación. La velocidad de sedimentación se puede controlar durante el experimento para calcular el peso molecular . Se pueden calcular los valores del coeficiente de sedimentación (S). Los valores altos de S (velocidad de sedimentación más rápida) corresponden a un mayor peso molecular. Las partículas densas sedimentan más rápidamente. Las proteínas alargadas tienen coeficientes de fricción más altos y sedimentan más lentamente para garantizar la precisión. [9]
La diferencia entre las técnicas de centrifugación diferencial y de gradiente de densidad es que el último método utiliza soluciones de diferentes densidades (por ejemplo, sacarosa , Ficoll , Percoll ) o geles a través de los cuales pasa la muestra. Esto separa la muestra en capas por densidad relativa, basándose en el principio de que las moléculas se sedimentan bajo una fuerza centrífuga hasta que alcanzan un medio con la misma densidad que la suya. [10] El grado de separación o número de capas depende de la solución o el gel. La centrifugación diferencial, por otro lado, no utiliza un gradiente de densidad y la centrifugación se realiza a velocidades crecientes. Las diferentes velocidades de centrifugación a menudo crean una separación en no más de dos fracciones, por lo que el sobrenadante se puede separar aún más en pasos de centrifugación adicionales. Para eso, en cada paso se debe aumentar la velocidad de centrifugación hasta que se separen las partículas deseadas. Por el contrario, la centrifugación de gradiente de densidad generalmente se realiza con una sola velocidad de centrifugación. [11]
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