Diagrama de Lineweaver-Burk

Gráfica de la cinética enzimática

Un ejemplo de un gráfico de Lineweaver-Burk de 1/ v contra 1/ a

En bioquímica , el diagrama de Lineweaver-Burk (o diagrama recíproco doble ) es una representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten de cinética enzimática , descrita por Hans Lineweaver y Dean Burk en 1934. ^[1]

El gráfico recíproco doble distorsiona la estructura de error de los datos y, por lo tanto, no es la herramienta más precisa para la determinación de los parámetros cinéticos de las enzimas. ^[2] Si bien el gráfico de Lineweaver-Burk se ha utilizado históricamente para la evaluación de los parámetros, junto con las formas lineales alternativas de la ecuación de Michaelis-Menten, como el gráfico de Hanes-Woolf o el gráfico de Eadie-Hofstee , se deben evitar todas las formas linealizadas de la ecuación de Michaelis-Menten para calcular los parámetros cinéticos. Los métodos de regresión no lineal ponderados adecuadamente son significativamente más precisos y se han vuelto generalmente accesibles con la disponibilidad universal de las computadoras de escritorio.

Definiciones

El gráfico de Lineweaver-Burk se deriva de una transformación de la ecuación de Michaelis-Menten ,

${\displaystyle v={\frac {Va}{K_{\mathrm {m} }+a}}}$

en la que la velocidad es una función de la concentración del sustrato y dos parámetros , la velocidad límite y la constante de Michaelis . Si tomamos los recíprocos de ambos lados de esta ecuación, queda como sigue: ${\displaystyle v}$ ${\displaystyle a}$ ${\displaystyle V}$ ${\displaystyle K_{\mathrm {m} }}$

${\displaystyle {\frac {1}{v}}={\frac {1}{V}}+{\frac {K_{\mathrm {m} }}{V}}\cdot {\frac {1}{a}}}$

De esta manera, al trazar contra se genera una línea recta con intersección en ordenadas , intersección en abscisas y pendiente . ${\displaystyle 1/v}$ ${\displaystyle 1/a}$ ${\displaystyle 1/V}$ ${\displaystyle -1/K_{\mathrm {m} }}$ ${\displaystyle K_{\mathrm {m} }/V}$

Aplicaciones

Efectos de diferentes tipos de inhibición en la trama de doble reciprocidad

Cuando se utiliza para determinar el tipo de inhibición enzimática, el diagrama de Lineweaver-Burk permite distinguir entre inhibidores competitivos , no competitivos puros y no competitivos . Los distintos modos de inhibición se pueden comparar con la reacción no inhibida.

Inhibición competitiva

El valor aparente de no se ve afectado por los inhibidores competitivos. Por lo tanto, los inhibidores competitivos tienen el mismo punto de corte en la ordenada que las enzimas no inhibidas. ${\displaystyle V}$

La inhibición competitiva aumenta el valor aparente de o reduce la afinidad por el sustrato. Gráficamente, esto se puede ver como la enzima inhibida que tiene un punto de intersección más grande en la abscisa. ${\displaystyle K_{\mathrm {m} }}$

Inhibición pura no competitiva

Con una inhibición no competitiva pura, el valor aparente de disminuye. Esto se puede ver en el gráfico de Lineweaver-Burk como un incremento en la intersección con el eje de las ordenadas sin efecto en la intersección con el eje de las abscisas , ya que la inhibición no competitiva pura no afecta la afinidad del sustrato. ${\displaystyle V}$ ${\displaystyle -1/K_{\mathrm {m} }}$

Inhibición mixta

La inhibición no competitiva pura es poco frecuente y la inhibición mixta es mucho más común. En la inhibición mixta, el valor aparente de disminuye y el de cambia (normalmente aumenta), lo que significa que la afinidad suele disminuir con la inhibición mixta. ${\displaystyle V}$ ${\displaystyle K_{\mathrm {m} }}$

Cleland reconoció que la inhibición no competitiva pura era muy rara en la práctica y que ocurría principalmente con efectos de protones y algunos iones metálicos, y redefinió la no competitiva para significar mixta . ^[3] Muchos autores lo han seguido en este sentido, pero no todos.

Inhibición no competitiva

El valor aparente de disminuye con la inhibición no competitiva, con el de . Esto se puede ver en el gráfico de Lineweaver-Burk como un incremento en la intersección en la ordenada sin cambios en la pendiente. ${\displaystyle V}$ ${\displaystyle V/K_{\mathrm {m} }}$

La afinidad del sustrato aumenta con la inhibición no competitiva o disminuye el valor aparente de . La inhibición no competitiva se puede identificar gráficamente en las líneas paralelas del gráfico para las diferentes concentraciones de inhibidor. ${\displaystyle K_{\mathrm {m} }}$

Defectos

El gráfico de Lineweaver-Burk no es muy bueno para visualizar el error experimental. ^[4] En concreto, si los errores tienen errores estándar uniformes, entonces varían en un rango muy amplio, como se puede ver en el siguiente ejemplo: ${\displaystyle \varepsilon (v)}$ ${\displaystyle 1/v}$

Si entonces el rango es 0,91–1,11, aproximadamente el 20% ${\displaystyle v=1\pm 0.1}$ ${\displaystyle 1/v}$

Si (misma desviación estándar) entonces el rango es 0,0990–0,1001, aproximadamente 1%. ${\displaystyle v=10\pm 0.1}$ ${\displaystyle 1/v}$

Lineweaver y Burk eran conscientes de este problema y, tras investigar la distribución del error de forma experimental ^[5] y encontrar una desviación estándar uniforme en , consultaron al eminente estadístico W. Edwards Deming ^[6] . A la luz de su consejo, utilizaron pesos de para ajustar su . Este aspecto de su trabajo ha sido ignorado casi universalmente por las personas que hacen referencia al "método de Lineweaver y Burk". ^{[ cita requerida ]} ${\displaystyle v}$ ${\displaystyle v^{4}}$ ${\displaystyle 1/v}$

Los valores medidos en valores bajos , y por lo tanto grandes, de conducen a puntos en el extremo derecho del gráfico y tienen un gran efecto en la pendiente de la línea y, por lo tanto, en particular en el valor de . ${\displaystyle a}$ ${\displaystyle 1/a}$ ${\displaystyle K_{\mathrm {m} }}$

Véase también

• Cinética de Michaelis-Menten
• El complot de Eadie-Hofstee
• Diagrama de Hanes-Woolf
• Trazado lineal directo

Referencias

1. Lineweaver, Hans; Burk, Dean (marzo de 1934). "La determinación de las constantes de disociación enzimática". Revista de la Sociedad Química Americana . 56 (3): 658–666. doi :10.1021/ja01318a036. ISSN  0002-7863.
2. Greco, WR; Hakala, MT (1979-12-10). "Evaluación de métodos para estimar la constante de disociación de inhibidores de enzimas de unión fuerte". The Journal of Biological Chemistry . 254 (23): 12104–12109. doi : 10.1016/S0021-9258(19)86435-9 . ISSN  0021-9258. PMID  500698.
3. Cleland, WW "La cinética de las reacciones catalizadas por enzimas con dos o más sustratos o productos: II. Inhibición: Nomenclatura y teoría". Biochim. Biophys. Acta . 67 (2): 173–187. doi :10.1016/0926-6569(63)90226-8.
4. Dowd, John E.; Riggs, Douglas S. (febrero de 1965). "Una comparación de estimaciones de constantes cinéticas de Michaelis-Menten a partir de varias transformaciones lineales". Journal of Biological Chemistry . 240 (2): 863–869. doi : 10.1016/s0021-9258(17)45254-9 . ISSN  0021-9258.
5. Burk, D. "Nitrogenasa". Ergebnisse der Enzymforschung . 3 : 23–56.
6. Lineweaver H, Burk D, Deming, WE (1934). "La constante de disociación de la nitrógeno-nitrogenasa en Azobacter ". J. Amer. Chem. Soc . 56 : 225–230. doi :10.1021/ja01316a071.{{cite journal}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )

Enlaces externos

• Guía del NIH sobre desarrollo y análisis de ensayos enzimáticos