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gen reportero

Un diagrama de cómo se utiliza un gen informador para estudiar una secuencia reguladora.

En biología molecular , un gen reportero (a menudo simplemente reportero ) es un gen que los investigadores adjuntan a una secuencia reguladora de otro gen de interés en bacterias , cultivos celulares , animales o plantas. Estos genes se denominan informadores porque las características que confieren a los organismos que los expresan se identifican y miden fácilmente, o porque son marcadores seleccionables . Los genes indicadores se utilizan a menudo como indicación de si un determinado gen ha sido absorbido o expresado en la población de células u organismos.

Genes reporteros comunes

Para introducir un gen indicador en un organismo, los científicos colocan el gen indicador y el gen de interés en la misma construcción de ADN que se insertará en la célula u organismo. Para bacterias o células procarióticas en cultivo, esto suele tener la forma de una molécula de ADN circular llamada plásmido . En el caso de los virus , esto se conoce como vector viral . Es importante utilizar un gen informador que no se exprese de forma nativa en la célula u organismo bajo estudio, ya que la expresión del gen informador se utiliza como marcador para la absorción exitosa del gen de interés. [1]

Los genes indicadores de uso común que inducen características visualmente identificables generalmente involucran proteínas fluorescentes y luminiscentes . Los ejemplos incluyen el gen que codifica la proteína fluorescente verde de medusa (GFP), que hace que las células que la expresan brillen en verde bajo luz azul o ultravioleta, [2] la enzima luciferasa , que cataliza una reacción con luciferina para producir luz, y la proteína fluorescente roja. proteína del gen dsRed  [fr] . [3] [4] [5] [6] [7] El gen GUS se ha utilizado comúnmente en plantas, pero la luciferasa y la GFP se están volviendo más comunes. [8] [9]

Un informador común en las bacterias es el gen lacZ de E. coli , que codifica la proteína beta-galactosidasa . [10] Esta enzima hace que las bacterias que expresan el gen aparezcan de color azul cuando se cultivan en un medio que contiene el sustrato análogo X-gal . Un ejemplo de marcador seleccionable que también es informador en bacterias es el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), que confiere resistencia al antibiótico cloranfenicol . [11]

Ensayos de transformación y transfección.

Muchos métodos de transfección y transformación (dos formas de expresar un gen extraño o modificado en un organismo) son eficaces sólo en un pequeño porcentaje de una población sometida a las técnicas. [13] [14] Por lo tanto, es necesario un método para identificar esos pocos eventos exitosos de absorción de genes. Los genes indicadores utilizados de esta manera normalmente se expresan bajo su propio promotor (regiones de ADN que inician la transcripción del gen) independiente del gen de interés introducido; el gen informador puede expresarse de forma constitutiva (es decir, "siempre activo") o induciblemente con una intervención externa como la introducción de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) en el sistema de β-galactosidasa. [10] Como resultado, la expresión del gen informador es independiente de la expresión del gen de interés, lo cual es una ventaja cuando el gen de interés solo se expresa bajo ciertas condiciones específicas o en tejidos de difícil acceso. [1]

En el caso de marcadores seleccionables como CAT, la población de bacterias transfectadas se puede cultivar en un sustrato que contenga cloranfenicol . Sólo aquellas células que hayan adoptado con éxito la construcción que contiene el gen CAT sobrevivirán y se multiplicarán en estas condiciones. [11]

Ensayos de expresión genética.

Los genes indicadores se pueden utilizar para analizar la expresión de un gen de interés que normalmente es difícil de analizar cuantitativamente. [1] Los genes reporteros pueden producir una proteína que tiene poco efecto obvio o inmediato en el cultivo celular o en el organismo. Lo ideal es que no estén presentes en el genoma nativo para poder aislar la expresión del gen informador como resultado de la expresión del gen de interés. [1] [15]

Para activar los genes informadores, se pueden expresar de forma constitutiva , donde se unen directamente al gen de interés para crear una fusión genética . [16] Este método es un ejemplo del uso de elementos que actúan en cis donde los dos genes están bajo los mismos elementos promotores y se transcriben en una única molécula de ARN mensajero . Luego, el ARNm se traduce en proteína. Es importante que ambas proteínas puedan plegarse adecuadamente en sus conformaciones activas e interactuar con sus sustratos a pesar de estar fusionadas. En la construcción de la construcción de ADN, generalmente se incluye un segmento de ADN que codifica una región conectora de polipéptido flexible de modo que el indicador y el producto génico sólo interfieran mínimamente entre sí. [17] [18] Los genes indicadores también se pueden expresar por inducción durante el crecimiento. En estos casos, se utilizan elementos que actúan en trans , como factores de transcripción, para expresar el gen informador. [19] [20]

Los ensayos de genes informadores se han utilizado cada vez más en la detección de alto rendimiento (HTS) para identificar inhibidores y activadores de moléculas pequeñas de dianas proteicas y vías para el descubrimiento de fármacos y la biología química . Debido a que las propias enzimas informadoras (por ejemplo, la luciferasa de luciérnaga ) pueden ser objetivos directos de moléculas pequeñas y confundir la interpretación de los datos HTS, se han desarrollado nuevos diseños de indicadores de coincidencias que incorporan supresión de artefactos. [21] [22]

Ensayos de promotor

Se pueden usar genes indicadores para analizar la actividad de un promotor particular en una célula u organismo. [23] En este caso no existe un "gen de interés" separado; el gen indicador simplemente se coloca bajo el control del promotor objetivo y la actividad del producto del gen indicador se mide cuantitativamente. Los resultados normalmente se informan en relación con la actividad bajo un promotor "consenso" que se sabe que induce una fuerte expresión genética. [24]

Otros usos

Un uso más complejo de genes indicadores a gran escala es el cribado de dos híbridos , cuyo objetivo es identificar proteínas que interactúan de forma nativa entre sí in vivo . [25]

Ver también

Referencias

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  2. ^ van Thor, Jasper J.; Gensch, Thomas; Hellingwerf, Klaas J.; Johnson, Louise N. (enero de 2002). "La fototransformación de la proteína verde fluorescente con luz ultravioleta y luz visible conduce a la descarboxilación del glutamato 222". Biología estructural de la naturaleza . 9 (1): 37–41. doi :10.1038/nsb739. ISSN  1072-8368. PMID  11740505.
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