La fragmentación describe el proceso de división en varias piezas o fragmentos. En biología celular , la fragmentación es útil para una célula tanto durante la clonación de ADN como durante la apoptosis. La clonación de ADN es importante en la reproducción asexual o la creación de moléculas de ADN idénticas, y puede ser realizada espontáneamente por la célula o intencionalmente por investigadores de laboratorio. La apoptosis es la destrucción programada de células y de las moléculas de ADN dentro de ellas, y es un proceso altamente regulado. Estas dos formas en las que se utiliza la fragmentación en los procesos celulares describen funciones celulares normales y procedimientos de laboratorio comunes que se realizan con las células. Sin embargo, los problemas dentro de una célula a veces pueden causar fragmentación que da como resultado irregularidades como la fragmentación de glóbulos rojos y la fragmentación del ADN de los espermatozoides.
Clonación de ADN
La clonación de ADN puede ser realizada de forma espontánea por la célula con fines reproductivos. Se trata de una forma de reproducción asexual en la que un organismo se divide en fragmentos y luego cada uno de estos fragmentos se convierte en individuos maduros y completamente desarrollados que son clones del organismo original (véase fragmentación reproductiva ). La clonación de ADN también puede ser realizada intencionadamente por investigadores de laboratorio. En este caso, la fragmentación de ADN es una técnica genética molecular que permite a los investigadores utilizar la tecnología del ADN recombinante para preparar grandes cantidades de moléculas de ADN idénticas. Para que se complete la clonación de ADN, es necesario obtener regiones pequeñas y discretas del ADN de un organismo que constituyan genes específicos . Solo se pueden clonar moléculas de ADN relativamente pequeñas en cualquier vector disponible . Por lo tanto, las largas moléculas de ADN que componen el genoma de un organismo deben escindirse en fragmentos que se puedan insertar en el ADN del vector. [1] Dos enzimas facilitan la producción de dichas moléculas de ADN recombinante:
Las enzimas de restricción son endonucleasas producidas por bacterias que normalmente reconocen secuencias de pares de bases pequeñas (llamadas sitios de restricción ) y luego cortan ambas cadenas de ADN en este sitio. [2] Un sitio de restricción es típicamente una secuencia palindrómica , lo que significa que la secuencia del sitio de restricción es la misma en cada cadena de ADN cuando se lee en la dirección 5' a 3'.
Para cada enzima de restricción, las bacterias también producen una enzima de modificación para proteger el ADN de la bacteria huésped de la escisión. Esto se hace modificando el ADN huésped en cada sitio de escisión potencial o cerca de él. La enzima de modificación agrega un grupo metilo a una o dos bases, y la presencia de este grupo metilo evita que la endonucleasa de restricción corte el ADN. [3]
Corte que crea un extremo pegajosoCorte que crea un extremo romo
Muchas enzimas de restricción realizan cortes escalonados en las dos cadenas de ADN en su sitio de reconocimiento, lo que genera fragmentos con una "cola" monocatenaria que sobresale en ambos extremos, llamada extremo pegajoso. Las enzimas de restricción también pueden realizar cortes rectos en las dos cadenas de ADN en su sitio de reconocimiento, lo que genera extremos romos. [4]
Durante la replicación normal del ADN, la ADN ligasa cataliza la unión de extremo a extremo (ligación) de fragmentos cortos de ADN, llamados fragmentos de Okazaki . Para la clonación de ADN, se utiliza la ADN ligasa purificada para unir covalentemente los extremos de un fragmento de restricción y un ADN vector que tienen extremos complementarios. Se ligan covalentemente entre sí a través de los enlaces fosfodiéster 3' a 5' estándar del ADN. [5]
La ADN ligasa puede ligar extremos pegajosos y romos complementarios , pero la ligadura de extremos romos es ineficiente y requiere una mayor concentración tanto de ADN como de ADN ligasa que la ligadura de extremos pegajosos. [6] Por esta razón, la mayoría de las enzimas de restricción utilizadas en la clonación de ADN realizan cortes escalonados en las cadenas de ADN para crear extremos pegajosos.
La clave para clonar un fragmento de ADN es unirlo a una molécula de ADN vector que pueda replicarse dentro de una célula huésped. Después de introducir una única molécula de ADN recombinante (compuesta por un vector más un fragmento de ADN insertado) en una célula huésped, el ADN insertado puede replicarse junto con el vector, generando una gran cantidad de moléculas de ADN idénticas. [7]
El esquema básico para esto puede resumirse de la siguiente manera:
Vector + Fragmento de ADN
↓
ADN recombinante
↓
Replicación del ADN recombinante dentro de la célula huésped
↓
Aislamiento, secuenciación y manipulación de fragmentos de ADN purificados
Existen numerosas variaciones experimentales de este esquema, pero estos pasos son esenciales para la clonación de ADN en un laboratorio. [8]
Apoptosis
La fragmentación es el tercer y último paso del desmontaje celular durante la apoptosis (lado derecho del esquema). [9]
La apoptosis se refiere a la muerte de células por una forma específica de muerte celular programada , caracterizada por una secuencia bien definida de cambios morfológicos. [10] La contracción celular y nuclear, la condensación y fragmentación de la cromatina, la formación de cuerpos apoptóticos y la fagocitosis por células vecinas caracterizan los principales cambios morfológicos en el proceso de apoptosis. [11] Los cambios morfológicos y bioquímicos extensos durante la apoptosis aseguran que las células moribundas dejen un impacto mínimo en las células y/o tejidos vecinos.
Los genes implicados en el control de la muerte celular codifican proteínas con tres funciones distintas: [12]
Las proteínas "asesinas" son necesarias para que una célula comience el proceso apoptótico.
Las proteínas de "destrucción" hacen cosas como digerir el ADN en una célula moribunda.
Las proteínas de "engullimiento" son necesarias para la fagocitosis de la célula moribunda por otra célula.
La escisión del ADN cromosómico en fragmentos más pequeños es una parte integral y un sello bioquímico distintivo de la apoptosis. La apoptosis implica la activación de endonucleasas con la escisión posterior del ADN de la cromatina en fragmentos de 180 pares de bases o múltiplos de 180 pares de bases (por ejemplo, 360, 540). Este patrón de fragmentación se puede utilizar para detectar la apoptosis en pruebas como un ensayo de escalera de ADN con electroforesis en gel , un ensayo TUNEL o un ensayo de Nicoletti . [13]
La fragmentación del ADN apoptótico depende de una enzima llamada ADNasa activada por caspasa (CAD) . [14] La CAD suele ser inhibida por otra proteína en la célula, llamada inhibidor de la ADNasa activada por caspasa (ICAD) . [15] Para que comience la apoptosis, una enzima llamada caspasa 3 escinde la ICAD para que la CAD se active. Luego, la CAD corta el ADN entre los nucleosomas , que se encuentran en la cromatina a intervalos de 180 pares de bases. Los sitios entre los nucleosomas son las únicas partes del ADN que están expuestas y son accesibles a la CAD. [16]
Irregularidades
La fragmentación del ADN puede ocurrir en determinadas condiciones en algunos tipos de células diferentes. Esto puede provocar problemas en una célula o hacer que reciba una señal para que se someta a apoptosis. A continuación, se muestran un par de ejemplos de fragmentación irregular que puede ocurrir en las células.
1. Fragmentación de glóbulos rojos
Frotis de sangre de un paciente con anemia hemolítica, que muestra esquistocitos.
Un glóbulo rojo fragmentado se conoce como esquistocito y generalmente es el resultado de una lesión mecánica intracelular al glóbulo rojo. [17] Se puede observar una amplia variedad de esquistocitos. Los esquistocitos generalmente se ven en cantidades relativamente bajas y están asociados con afecciones en las que el revestimiento endotelial normalmente liso, o endotelio , está rugoso o irregular, y/o el lumen vascular está atravesado por hebras de fibrina . [18] Los esquistocitos se ven comúnmente en pacientes que tienen anemia hemolítica . También son una característica de la anemia por deficiencia de hierro avanzada , pero en este caso la fragmentación observada es más probablemente el resultado de la fragilidad de las células producidas en estas condiciones.
2. Fragmentación del ADN de los espermatozoides
En un hombre promedio, menos del 4% de sus células espermáticas contendrán ADN fragmentado. Sin embargo, la participación en conductas como fumar puede aumentar significativamente la fragmentación del ADN en las células espermáticas. Existe una correlación negativa entre el porcentaje de fragmentación del ADN y la motilidad, la morfología y la concentración de los espermatozoides. También existe una asociación negativa entre el porcentaje de espermatozoides que contienen ADN fragmentado y la tasa de fertilización y la tasa de división del embrión. [19]
Referencias
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^ Rao, Desirazu N., Swati Saha y Vinita Krishnamurthy. "Enzimas de restricción dependientes de ATP". Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology 64 (2000): 1-63. Versión impresa.
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