La fragmentación describe el proceso de dividir en varios pedazos o fragmentos. En biología celular , la fragmentación es útil para una célula tanto durante la clonación del ADN como durante la apoptosis. La clonación de ADN es importante en la reproducción asexual o en la creación de moléculas de ADN idénticas, y puede ser realizada de forma espontánea por la célula o intencionalmente por investigadores de laboratorio. La apoptosis es la destrucción programada de las células y de las moléculas de ADN que contienen, y es un proceso altamente regulado. Estas dos formas en que se utiliza la fragmentación en los procesos celulares describen funciones celulares normales y procedimientos de laboratorio comunes realizados con células. Sin embargo, los problemas dentro de una célula a veces pueden causar fragmentación que resulta en irregularidades como la fragmentación de los glóbulos rojos y la fragmentación del ADN de los espermatozoides.
Clonación de ADN
La célula puede realizar la clonación de ADN de forma espontánea con fines reproductivos. Esta es una forma de reproducción asexual en la que un organismo se divide en fragmentos y luego cada uno de estos fragmentos se convierte en individuos maduros y completamente desarrollados que son clones del organismo original (ver fragmentación reproductiva ). Los investigadores de laboratorio también pueden realizar intencionalmente la clonación de ADN. En este caso, la fragmentación del ADN es una técnica genética molecular que permite a los investigadores utilizar tecnología de ADN recombinante para preparar grandes cantidades de moléculas de ADN idénticas. Para que se complete la clonación de ADN, es necesario obtener regiones pequeñas y discretas del ADN de un organismo que constituyen genes específicos . En cualquier vector disponible sólo se pueden clonar moléculas de ADN relativamente pequeñas . Por lo tanto, las largas moléculas de ADN que componen el genoma de un organismo deben escindirse en fragmentos que puedan insertarse en el ADN vector. [1] Dos enzimas facilitan la producción de tales moléculas de ADN recombinante:
Las enzimas de restricción son endonucleasas producidas por bacterias que normalmente reconocen secuencias de pares de bases pequeñas (llamadas sitios de restricción ) y luego escinden ambas hebras de ADN en este sitio. [2] Un sitio de restricción suele ser una secuencia palindrómica , lo que significa que la secuencia del sitio de restricción es la misma en cada cadena de ADN cuando se lee en la dirección 5' a 3'.
Para cada enzima de restricción, las bacterias también producen una enzima de modificación para que el propio ADN de la bacteria huésped quede protegido contra la escisión. Esto se hace modificando el ADN del huésped en o cerca de cada sitio de escisión potencial. La enzima de modificación añade un grupo metilo a una o dos bases, y la presencia de este grupo metilo evita que la endonucleasa de restricción corte el ADN. [3]
Corte que crea un extremo pegajoso.Corte que crea un extremo romo.
Muchas enzimas de restricción realizan cortes escalonados en las dos cadenas de ADN en su sitio de reconocimiento, lo que genera fragmentos con una "cola" monocatenaria que sobresale en ambos extremos, llamada extremo pegajoso. Las enzimas de restricción también pueden realizar cortes rectos en las dos cadenas de ADN en su sitio de reconocimiento, lo que genera extremos romos. [4]
Durante la replicación normal del ADN, la ADN ligasa cataliza la unión (ligación) de extremo a extremo de fragmentos cortos de ADN, llamados fragmentos de Okazaki . Para fines de clonación de ADN, se utiliza ADN ligasa purificada para unir covalentemente los extremos de un fragmento de restricción y un ADN vector que tienen extremos complementarios. Están ligados covalentemente a través de los enlaces fosfodiéster estándar 3' a 5' del ADN. [5]
La ADN ligasa puede ligar extremos adhesivos y romos complementarios , pero la ligadura de extremos romos es ineficiente y requiere una mayor concentración tanto de ADN como de ADN ligasa que la ligación de extremos adhesivos. [6] Por esta razón, la mayoría de las enzimas de restricción utilizadas en la clonación de ADN realizan cortes escalonados en las cadenas de ADN para crear extremos pegajosos.
La clave para clonar un fragmento de ADN es vincularlo a una molécula de ADN vector que pueda replicarse dentro de una célula huésped. Después de introducir una única molécula de ADN recombinante (compuesta por un vector más un fragmento de ADN insertado) en una célula huésped, el ADN insertado puede replicarse junto con el vector, generando una gran cantidad de moléculas de ADN idénticas. [7]
El esquema básico para esto se puede resumir de la siguiente manera:
Vector + fragmento de ADN
↓
ADN recombinante
↓
Replicación del ADN recombinante dentro de la célula huésped.
↓
Aislamiento, secuenciación y manipulación de fragmentos de ADN purificados.
Existen numerosas variaciones experimentales de este esquema, pero estos pasos son esenciales para la clonación de ADN en un laboratorio. [8]
apoptosis
La fragmentación es el tercer y último paso del desmontaje celular durante la apoptosis (lado derecho del esquema). [9]
La apoptosis se refiere a la desaparición de las células mediante una forma específica de muerte celular programada , caracterizada por una secuencia bien definida de cambios morfológicos. [10] La contracción celular y nuclear, la condensación y fragmentación de la cromatina, la formación de cuerpos apoptóticos y la fagocitosis por células vecinas caracterizan los principales cambios morfológicos en el proceso de apoptosis. [11] Los cambios morfológicos y bioquímicos extensos durante la apoptosis aseguran que las células moribundas dejen un impacto mínimo en las células y/o tejidos vecinos.
Los genes implicados en el control de la muerte celular codifican proteínas con tres funciones distintas: [12]
Se necesitan proteínas "asesinas" para que una célula comience el proceso apoptótico
Las proteínas de "destrucción" hacen cosas como digerir el ADN en una célula moribunda
Se requieren proteínas de "engullimiento" para la fagocitosis de la célula moribunda por otra célula.
La división del ADN cromosómico en fragmentos más pequeños es una parte integral y un sello bioquímico de la apoptosis. La apoptosis implica la activación de endonucleasas con la posterior escisión del ADN de cromatina en fragmentos de 180 pares de bases o múltiplos de 180 pares de bases (p. ej., 360, 540). Este patrón de fragmentación se puede utilizar para detectar apoptosis en pruebas como un ensayo de escalera de ADN con electroforesis en gel , un ensayo TUNEL o un ensayo Nicoletti . [13]
La fragmentación apoptótica del ADN se basa en una enzima llamada ADNasa activada por caspasa (CAD) . [14] La CAD generalmente es inhibida por otra proteína en la célula, llamada inhibidor de la ADNasa activada por caspasa (ICAD) . [15] Para que comience la apoptosis, una enzima llamada caspasa 3 escinde ICAD para que CAD se active. Luego, CAD escinde el ADN entre los nucleosomas , que se encuentran en la cromatina en intervalos de 180 pares de bases. Los sitios entre los nucleosomas son las únicas partes del ADN que están expuestas y accesibles al CAD. [dieciséis]
Irregularidades
La fragmentación del ADN puede ocurrir bajo ciertas condiciones en algunos tipos de células diferentes. Esto puede causar problemas a una célula o puede hacer que una célula reciba una señal para sufrir apoptosis. A continuación se muestran un par de ejemplos de fragmentación irregular que puede ocurrir en las células.
1. Fragmentación de los glóbulos rojos
Un frotis de sangre de un paciente con anemia hemolítica, que muestra esquistocitos.
Un glóbulo rojo fragmentado se conoce como esquistocito y generalmente es el resultado de una lesión mecánica intracelular del glóbulo rojo. [17] Se puede observar una amplia variedad de esquistocitos. Los esquistocitos generalmente se observan en cantidades relativamente bajas y se asocian con afecciones en las que el revestimiento endotelial normalmente liso, o endotelio , es rugoso o irregular y/o la luz vascular está atravesada por hebras de fibrina . [18] Los esquistocitos se observan comúnmente en pacientes que tienen anemia hemolítica . También son una característica de la anemia por deficiencia de hierro avanzada , pero en este caso la fragmentación observada es muy probablemente el resultado de la fragilidad de las células producidas en estas condiciones.
2. Fragmentación del ADN de los espermatozoides
En un hombre promedio, menos del 4% de sus espermatozoides contendrán ADN fragmentado. Sin embargo, participar en conductas como fumar puede aumentar significativamente la fragmentación del ADN en los espermatozoides. Existe una correlación negativa entre el porcentaje de fragmentación del ADN y la motilidad, morfología y concentración de los espermatozoides. También existe una asociación negativa entre el porcentaje de espermatozoides que contienen ADN fragmentado y la tasa de fertilización y la tasa de escisión del embrión. [19]
Referencias
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